一种坛紫菜核心种质库的构建方法技术

一种坛紫菜核心种质库的构建方法，涉及坛紫菜。包括以下步骤：1)坛紫菜种质的收集和纯化；2)提取坛紫菜各种质品系基因组DNA；3)基于SSR分子标记的坛紫菜种质品系遗传多样性分析；4)计算各种质品系间遗传相似性系数；5)逐步聚类取样构建核心种质库。得到的核心种质库能以最少的样品数量最大程度地保存原种质的遗传多样性，从而简化后续坛紫菜杂交育种时进行亲本组配的环节，提高育种效率和育种成效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及坛紫菜，尤其是涉及一种坛紫菜核心种质库的构建方法。
技术介绍
坛紫菜(Pyropia haitanensis)原产于我国南方沿海潮间带的岩石上，是我国特有的暖温带性种类。自上世纪60年代全人工栽培取得成功以来，坛紫菜的栽培面积不断扩大，目前已成为我国浙江南部、福建和广东北部沿海海水养殖的主要对象之一，创造了可观的经济效益。海洋生物种质资源是“蓝色农业”的基础。野生坛紫菜作为坛紫菜遗传育种的基础，遗传多样性丰富，但近些年随着海域的开发，人为的滥采和乱采，野生坛紫菜的资源遭受严重破坏，野生优良种质正逐渐消失。为有效保护和利用坛紫菜的种质资源，集美大学坛紫菜课题组从2000年开始启动了坛紫菜种质资源库项目，截止目前已经构建了一个包含500多份种质材料的坛紫菜种质资源库，但如何准确评价这些资源、有效挖掘优异种质资源并为坛紫菜的遗传育种服务是目前亟需解决的重要科学问题。核心种质的概念最早是由Frankel和Brown提出的，即通过一定的方法从整个种质资源中选择一部分样本，以最小的资源数量和遗传重复，尽可能最大限度的代表整个资源的多样性(Frankel OH，Brown AHD.Plant genetic resources today：a critical appraisal.In：Hoden H W，Williams JT(Eds),Crop genetic resources：conservation and evaluation.Geoge Allen and Unwin，London，UK，1984，pp 249-257)。因此，核心种质库构建的要求就是应尽量多地包含该种质的生态和遗传多样性，但同时也并非样品的简单压缩，是在保证核心样品间生态和遗传相似性尽量小的前提下剔除多余的重复，用最少的遗传材料份数代表整个资源库，为遗传研究以及育种利用提供直接材料，提高育种效率。核心种质库构建的一般步骤包括：数据的收集整理，取样策略研究和核心种质的评价鉴定。常用于核心种质库构建的数据有农艺表型性状数据和分子标记数据。取样策略是指从整个种质资源中提取部分样品作为核心种质的取样方法，是核心种质库构建的关键环节，它关系到所构建的核心种质库是否能很好的代表所有种质。取样策略的确定又包括：分组原则，取样比例，组内取样方法等。分组原则一般是根据种质的遗传相似程度将全部种质进行分组，将遗传上相似的种质分在一组。分组数目与所收集种质的材料规模，遗传结构以及所期望的最低分组水平差异的程度有关，常见的分组依据包括分类体系，地理、生态、育种体系、多变量分析等。取样比例应依据所研究的种质资源材料的遗传多样性状况而定，目前国内外所构建核心种质库的取样比例一般为5％-40％。组内取样方法种类繁多，应依据具体的研究对象和遗传多样性的状况确定，常用的方法有随机取样法、位点优先取样法和变异度取样法等。核心种质库构建时存在一个取样比例问题，由于任何取样比例都不能确保所抽取的种质间遗传相似性最小，因此必须对不同抽样比率下构建的核心种质库进行评价。通过评价指标判断所构建的核心种质库是否存在遗传重复或者冗余的种质，或者核心种质的保有性很低的情况。评价所构建的核心种质库是否能很好地代表原群体的遗传多样性，主要通过评价离散型性状的遗传多样性指标和呈连续变异性状的遗传多样性指标进行评价。评价离散性状的遗传多样性一般使用Shannon-Weaver多样信息指数和Nei’s多样性指数(He)；对于连续变异性状遗传多样性，则一般采用表型频率方差、多样性指数、变异系数、表型保留比例和表型方差等进行评价。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种坛紫菜核心种质库的构建方法。本专利技术包括以下步骤：1)坛紫菜种质的收集和纯化，具体方法如下：(1)将收集到的坛紫菜种质样品，取单株叶状体，表面清洗后阴干和冷冻，将冷冻后的藻体取出，再次清洗后静水弱光复苏；在步骤1)第(1)部分中，所述冷冻的温度可为-18℃；所述再次清洗可采用消毒海水清洗；所述静水弱光复苏的条件可为：时间24h，培养条件为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D。(2)取藻体的营养组织块，置于葡萄糖溶液中浸泡，然后将藻体块剪成小块，放置于海螺酶溶液中酶解，酶解期间观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后再重复离心；在步骤1)第(2)部分中，所述藻体的营养组织块的大小可为0.5～1cm2；所述葡萄糖溶液的摩尔浓度可为2mol/L；所述浸泡的时间可为10min；所述酶解的酶液配方可为：0.12g海螺酶、1.27g甘露醇、2.2mg无水CaCl2、2.4mg MgSO4、10ml盐度为37的消毒海水，pH调至6～6.2；所述酶解的条件可为：黑暗振荡，温度为27℃，酶解时间为1～2h；所述酶解期间观察细胞解离状况可每隔30min观察细胞解离状况；所述过滤可采用300目筛绢过滤；所述滤液离心的条件可在1500r/min下离心3min；所述洗涤可采用盐度为37的消毒海水洗涤；所述重复离心可重复离心2次。(3)将收集到的细胞放入海水中黑暗培养后，再继续培养20～30d，将培养皿中的丝状体吸出，即获得纯系种质丝状体，再将纯系种质丝状体静水培养，进行保种；在步骤1)第(3)部分中，所述海水可采用盐度为37的消毒海水；所述黑暗培养的方法可为：每隔12h更换1/2MES培养液，连续更换3～4次；所述继续培养的条件可为：光照1000～2000Lx，12L:12D，温度20±1℃，每7d更换一次MES培养液；所述MES培养液的组成如下：NaNO3 0.0425g、KI 8.4×10-4g、NaH2PO4 6×10-3g、FeC6H5O7 2.6×10-4g、Tris 0.061g、VB1 5×10-7g、HBO3 0.0155g、VB2 1×10-6g，加灭菌海水定容至1000ml。(4)将第(3)部分静水培养后的纯系种质丝状体切碎，然后黑暗静置培养1d，第2d更换MES培养液后恢复正常光照静置培养，培养期间每15d更换MES培养液，直到获得足够用于基因组DNA提取的丝状体；在步骤1)第(4)部分中，所述切碎可将纯系丝状体用高温消毒后的组织粉碎机切碎至100～500μm；所述黑暗静置培养1d，第2d更换MES培养液后恢复正常光照静置培养，可置于500ml的锥形瓶中黑暗静置培养1d，第2d更换200～300ml MES培养液后恢复正常光照静置培养，在MES培养液中纯系种质丝状体的含量可在每100ml MES培养液中含1g湿重自由丝状体；所述正常光照静置培养的条件可为：温度21±1℃、光强1000～2000Lx，光周期12L︰12D。所述MES培养液的组成如下：NaNO3 0.0425g、KI 8.4×10-4g、NaH2PO4 6×10-3g、FeC6H5O7 2.6×10-4g、Tris 0.061g、VB1 5×10-7g、HBO3 0.0155g、VB2 1×10-6g，加灭菌海水定容至1000ml。2)提取坛紫菜各种质品系基因组DNA；在步骤2)中，所述提取坛紫菜各种质品系基因组DNA可采用CTAB法分别提取坛紫菜各种质品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种坛紫菜核心种质库的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)坛紫菜种质的收集和纯化，具体方法如下：(1)将收集到的坛紫菜种质样品，取单株叶状体，表面清洗后阴干和冷冻，将冷冻后的藻体取出，再次清洗后静水弱光复苏；(2)取藻体的营养组织块，置于葡萄糖溶液中浸泡，然后将藻体块剪成小块，放置于海螺酶溶液中酶解，酶解期间观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后再重复离心；(3)将收集到的细胞放入海水中黑暗培养后，再继续培养20～30d，将培养皿中的丝状体吸出，即获得纯系种质丝状体，再将纯系种质丝状体静水培养，进行保种；(4)将第(3)部分静水培养后的纯系种质丝状体切碎，然后黑暗静置培养1d，第2d更换MES培养液后恢复正常光照静置培养，培养期间每15d更换MES培养液，直到获得足够用于基因组DNA提取的丝状体；2)提取坛紫菜各种质品系基因组DNA；3)基于SSR分子标记的坛紫菜种质品系遗传多样性分析，具体方法如下：采用经过筛选的30对SSR引物对所有的种质品系进行遗传多样性分析，并按照分子量大小，对SSR标记所扩增的条带进行记录，有条带记为1，没有条带则记为0；所述30对SSR引物的序列见表1；表14)计算各种质品系间遗传相似性系数(GS)，具体方法如下：采用Nei&Li相似性系数GS，计算公式为GS(NLcij)＝2a/((a+b)+(a+c))，公式中a为两个品系共有的条带数；b、c为第i和第j品系各自的条带数；5)逐步聚类取样构建核心种质库。...

【技术特征摘要】
1.一种坛紫菜核心种质库的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)坛紫菜种质的收集和纯化，具体方法如下：(1)将收集到的坛紫菜种质样品，取单株叶状体，表面清洗后阴干和冷冻，将冷冻后的藻体取出，再次清洗后静水弱光复苏；(2)取藻体的营养组织块，置于葡萄糖溶液中浸泡，然后将藻体块剪成小块，放置于海螺酶溶液中酶解，酶解期间观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后再重复离心；(3)将收集到的细胞放入海水中黑暗培养后，再继续培养20～30d，将培养皿中的丝状体吸出，即获得纯系种质丝状体，再将纯系种质丝状体静水培养，进行保种；(4)将第(3)部分静水培养后的纯系种质丝状体切碎，然后黑暗静置培养1d，第2d更换MES培养液后恢复正常光照静置培养，培养期间每15d更换MES培养液，直到获得足够用于基因组DNA提取的丝状体；2)提取坛紫菜各种质品系基因组DNA；3)基于SSR分子标记的坛紫菜种质品系遗传多样性分析，具体方法如下：采用经过筛选的30对SSR引物对所有的种质品系进行遗传多样性分析，并按照分子量大小，对SSR标记所扩增的条带进行记录，有条带记为1，没有条带则记为0；所述30对SSR引物的序列见表1；表14)计算各种质品系间遗传相似性系数(GS)，具体方法如下：采用Nei&Li相似性系数GS，计算公式为GS(NLcij)＝2a/((a+b)+(a+c))，公式中a为两个品系共有的条带数；b、c为第i和第j品系各自的条带数；5)逐步聚类取样构建核心种质库。2.如权利要求1所述一种坛紫菜核心种质库的构建方法，其特征在于在步骤1)第(1)部分中，所述冷冻的温度为-18℃；所述再次清洗可采用消毒海水清洗；所述静水弱光复苏的条件可为：时间24h，培养条件为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D。3.如权利要求1所述一种坛紫菜核心种质库的构建方法，其特征在于在步骤1)第(2)部分中，所述藻体的营养组织块的大小为0.5～1cm2；所述葡萄糖溶液的摩尔浓度可为2mol/L；所述浸泡的时间可为10min。4.如权利要求1所述一种坛紫菜核心种质库的构建方法，其特征在于在步骤1)第(2)部分中，所述酶解的酶液配方为：0.12g海螺酶、1.27g甘露醇、2.2mg无水CaCl2、2.4mg MgSO4、10ml盐度为37的消毒海水，pH调至6～6.2；所述酶解的条件可为：黑暗振荡，温度为27℃，酶解时间为1～2h；所述酶解期间观察细胞解离状况可每隔30min观察细胞解离状况；所述过滤可采用300目筛绢过滤；所述滤液离心的条件可在1500r/min下离心3min；所述洗涤可采用盐度为37的消毒海水洗涤；所述重复离心可重复离心2次。...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢潮添，陈昌生，徐燕，纪德华，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35