一种兰州百合病程相关蛋白PR4基因定量检测的试剂盒及其检测方法，该试剂盒主要包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂、荧光定量PCR反应试剂以及阳性对照品和阴性对照品，特异性引物由兰州百合PR4基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成；阳性对照品为兰州百合PR4基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品；阴性对照品为DEPC水；本发明专利技术针对兰州百合PR4基因提供了一种快速、敏感、特异的定量检测试剂盒和检测方法，为兰州百合PR4基因的表达及检测诊断提供了技术支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种兰州百合病程相关蛋白PR4基因定量检测的试剂盒及检测方法。
技术介绍
百合是一种集观赏、食用和药用于一体的重要经济作物，长期无性繁殖使病毒不断积累，严重影响了产量和品质；其中百合斑驳病毒（LMoV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和百合隐症病毒（LSV）是最常见的三种病毒，感染率高达70%。病毒病造成百合种源严重退化，已是制约百合产业发展的重要因素，如何对病毒实现有效防治是百合产业健康发展急需解决的关键问题；目前，百合病毒防治技术非常落后，病毒防治主要采用杀灭传播介体蚜虫的方法，尽管能一定程度阻止病毒传播，然而已侵染的病毒仍会在百合上复制增殖；百合作为世界著名的球根花卉，至今还未开发出有效的百合病毒抑制剂，关于病毒抑制剂抗百合病毒作用机制的研究鲜有报道，使得现阶段对百合病毒病的防治非常盲目。通常病毒抑制剂抗植物病毒的作用方式有：抑制病毒侵染、抑制病毒增殖或诱导寄主产生抗性；诱导抗性作为一种有效的抗病手段，已在许多病害体系中得到应用，已有研究发现，某些病毒抑制剂可以诱导寄主产生抗病毒物质，提高寄主对病毒的抵抗力；江山等（1996）发现病毒抑制剂可以诱导寄主产生病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）；PRs是植物体内的一类蛋白质，受病原体或其他外界因子的胁迫而诱导表达，在植物抵御疾病、响应外界压力以及适应不良环境方面发挥着重要作用；根据病程相关蛋白家族成员的氨基酸组成、结构及生物学功能等特点，将其分为17类，即PR1~PR17，其中PR4是PRs家族中参与植物系统获得抗性的重要效应因子，PR4类蛋白在植物中普遍存在，主要是一类Mr13×103-16×103的小分子量蛋白，目前已经从烟草、马铃薯、大麦、番茄等作物中分离纯化出PR4蛋白，已发现的PR4蛋白都存在相同的Barwin保守结构，根据其分子N端几丁质结合位点的有无，PR4蛋白又可以分为PR4Ⅰ和PR4Ⅱ两类；已有证据表明PR4蛋白具有广泛的抗菌活性，并且PR4转基因的烟草和拟南芥对植物病原菌的抗性也有显著提高；通常，PRs蛋白在健康植株中表现微弱，当被不同的诱导因子诱导时迅速产生并积累，其与植物诱导抗性之间有密切的关联；因而研究病毒抑制剂对PR蛋白的诱导能力，是了解抗病毒制剂对植物是否具有诱导抗性作用的一个重要内容。在我们对百合抗病毒技术的开发研究中，初步筛选了2种适用于大田的百合病毒抑制剂，其对兰州百合主要病毒CMV的复制均有较好的抑制作用；同时，从病毒感染的兰州百合植株中也检测到了PR4基因的表达；为了进一步明确病毒抑制剂对PR4基因表达的影响，本研究建立了一种兰州百合病程相关蛋白PR4基因定量检测的试剂盒及检测方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种兰州百合PR4基因定量检测的试剂盒及检测方法。技术方案如下：一种兰州百合PR4基因定量检测的试剂盒，主要包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂以及荧光定量PCR反应试剂，特异性引物由兰州百合PR4基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成，特异性引物的序列如下：兰州百合PR4基因上游引物P1：5’-CGGGCAACCTACAACTACTACTAC-3’兰州百合PR4基因下游引物P2：5’-GCGGTCCAGCCATACTTCTT-3’内参18S rRNA基因上游引物P3：5’-GGGGAAACTTACCAGGTCCA-3’内参18S rRNA基因下游引物P4：5’-CAGACAAATCGCTCCACCAA-3’其中，扩增兰州百合PR4基因的片段长度为125bp，扩增内参18S rRNA基因片段长度为111bp。本专利技术的关键在于扩增引物的设计。为达到定量检测的要求，试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为兰州百合PR4基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品，阴性对照品为DEPC水；阳性对照品序列如下：兰州百合PR4基因标准品：cgggcaacctacaactactactacccggcacagaacaactgggacctcaacgccgtcagcgcctactgcgcaacatgggacgccagcaagcccttgtggtggcgcaagaagtatggctggaccgc;内参18S rRNA基因标准品：ggggaaacttaccaggtccagacatagtaaggattgacagactgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctg。可将上述阳性对照品序列构建到质粒载体中，测定质粒浓度后换算为拷贝数，然后用双蒸水将阳性质粒进行10倍梯度稀释，以10倍系列稀释的质粒溶液作为模板进行荧光定量PCR扩增，根据拷贝数的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照标准曲线即可获得待测样品起始cDNAs的精确拷贝数，再经过内参校正后最终获得待测样品PR4基因的标准拷贝数。本专利技术还涉及以上所述的检测兰州百合PR4基因表达的试剂盒的检测方法，其包括的步骤如下：步骤①以兰州百合叶片、茎杆或种球为待测样品，提取总RNA，进行反转录RT反应合成cDNAs；步骤②荧光定量PCR：以待测样品cDNAs作为模板，用检测PR4基因表达的上下游引物、检测内参基因18S rRNA表达的上下游引物分别进行荧光定量PCR扩增；以DEPC水为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增；步骤③数据采集与分析：上述步骤②反应结束后，利用计算机分析软件自动获得扩增曲线和溶解曲线，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线，若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，且溶解曲线形成单一的溶解峰，则判断为阳性。定量检测时，所述检测方法同时以10倍系列稀释的兰州百合PR4基因和18S rRNA基因标准品的质粒溶液进行荧光定量PCR检测，分别根据拷贝数的对数值与各标准品Ct值的关系绘制得到标准曲线，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照相应标准曲线获得待测样品起始cDNAs中PR4基因和18S rRNA基因的精确拷贝数，按照以下公式得到经过内参归一化校正后的待测样品PR4基因的标准拷贝数：其中，所述标准品序列如下：兰州百合PR4基因标准品：cgggcaacctacaactactactacccggcacagaacaactgggacctcaacgccgtcagcgcctactgcgcaacatgggacgccagcaagcccttgtggtggcgcaagaagtatggctggaccgc;内参18S rRNA基因标准品：ggggaaacttaccaggtccagacatagtaaggattgacagactgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctg。优选的，所述步骤①中反转录RT程序为：待测样品总RNA与PR4基因下游引物P2和18S rRNA基因下游引物P4混合后，70℃变性10min，迅速置冰上急冷2min; 再加入反转录RT缓冲液、dNTP混合物和反转录酶等，于42℃水浴1h, 70℃保温15min，制成待测样品cDNAs，置冰上待用。优选的，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种兰州百合PR4基因定量检测试剂盒，包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂以及荧光定量PCR反应试剂，所述特异性引物由兰州百合PR4基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成，所述特异性引物的序列如下：兰州百合PR4基因上游引物P1：5’‑CGGGCAACCTACAACTACTACTAC‑3’兰州百合PR4基因下游引物P2：5’‑GCGGTCCAGCCATACTTCTT‑3’内参18S rRNA基因上游引物P3：5’‑ GGGGAAACTTACCAGGTCCA ‑3’内参18S rRNA基因下游引物P4：5’ ‑CAGACAAATCGCTCCACCAA ‑3’其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为兰州百合PR4基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品，所述阴性对照品为DEPC水；所述阳性对照品序列如下：兰州百合PR4基因标准品：cgggcaacctacaactactactacccggcacagaacaactgggacctcaacgccgtcagcgcctactgcgcaacatgggacgccagcaagcccttgtggtggcgcaagaagtatggctggaccgc;内参18S rRNA基因标准品：ggggaaacttaccaggtccagacatagtaaggattgacagactgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctg;其特征在于将上述阳性对照品序列构建到质粒载体中，测定阳性质粒浓度后换算为拷贝数，然后用双蒸水将上述阳性质粒进行10倍梯度稀释，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液作为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4分别进行荧光定量PCR扩增，根据拷贝数的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到PR4基因和18S rRNA基因的标准曲线；同时将待测样品提取总RNA后进行反转录RT反应,以合成的cDNAs为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4在相同条件下进行荧光定量PCR扩增，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照标准曲线即可获得待测样品起始cDNAs中PR4基因和18S rRNA基因的精确拷贝数，再经过内参校正后最终获得待测样品PR4基因的标准拷贝数。...
【技术特征摘要】
1.一种兰州百合PR4基因定量检测试剂盒，包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂以及荧光定量PCR反应试剂，所述特异性引物由兰州百合PR4基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成，所述特异性引物的序列如下：兰州百合PR4基因上游引物P1：5’-CGGGCAACCTACAACTACTACTAC-3’兰州百合PR4基因下游引物P2：5’-GCGGTCCAGCCATACTTCTT-3’内参18S rRNA基因上游引物P3：5’- GGGGAAACTTACCAGGTCCA -3’内参18S rRNA基因下游引物P4：5’ -CAGACAAATCGCTCCACCAA -3’其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为兰州百合PR4基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品，所述阴性对照品为DEPC水；所述阳性对照品序列如下：兰州百合PR4基因标准品：cgggcaacctacaactactactacccggcacagaacaactgggacctcaacgccgtcagcgcctactgcgcaacatgggacgccagcaagcccttgtggtggcgcaagaagtatggctggaccgc;内参18S rRNA基因标准品：ggggaaacttaccaggtccagacatagtaaggattgacagactgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctg;其特征在于将上述阳性对照品序列构建到质粒载体中，测定阳性质粒浓度后换算为拷贝数，然后用双蒸水将上述阳性质粒进行10倍梯度稀释，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液作为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4分别进行荧光定量PCR扩增，根据拷贝数的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到PR4基因和18S rRNA基因的标准曲线；同时将待测样品提取总RNA后进行反转录RT反应,以合成...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玉宝，王乐，谢忠奎，王亚军，杨果，王若愚，郭志鸿，
申请(专利权)人：中国科学院寒区旱区环境与工程研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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