一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，具体步骤如下：（1）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建；（2）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救；（3）病毒扩增；（4）收集病毒颗粒；（5）病毒纯化；（6）半成品配制。本发明专利技术方法制备的活载体疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。

Method for preparing H7 subtype recombinant avian influenza virus live carrier vaccine seed

The invention discloses a preparation method of H7 subtype avian influenza virus recombinant live vector vaccine, the specific steps are as follows: (1) construction of recombinant H7N9/H7N7 subtype avian influenza virus HA adenovirus vector; (2) carrying the H7N9/H7N7 subtype of avian influenza virus HA recombinant adenovirus virus rescue; (3) virus amplification; (4) virus particles were collected; (5) virus purification; (6) preparation of semi-finished products. The live carrier vaccine prepared by the method of the invention has the advantages of strong immunogenicity, broad spectrum, stable quality, high purity, good safety and low cost, and is suitable for mass production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种活载体疫苗毒种的制备方法，具体是一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法。
技术介绍
流感是流行性感冒的简称，是由流感病毒引起的人兽共患传染性疾病，人感染后主要表现症状为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高；2013年4月以来发生的H7N9亚型流感，已对人、禽造成巨大威胁。目前，主要采用疫苗进行预防，所用疫苗包括病毒灭活疫苗、减毒疫苗、重组亚单位疫苗等。流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白覆盖，一型为血细胞凝集素（即H），一型为神经氨酸酶（即N），H 又分16个亚型，N 分9个亚型。其中H7亚型禽流感病毒对于禽类主要流行亚型有H7N3亚型、H7N7亚型，以及2013年开始感染人的H7N9亚型。历史上发生过H7亚型病毒感染哺乳类（包括人）的病毒有H7N7、H7N3、H7N9和H7N2等抗原组合，早在20年前就曾感染过人类，主要引发结膜炎和轻微的流感样症状，偶尔也曾引发死亡病例，尚未见在人与人之间传播。H7N7亚型禽流感病毒及H7N9亚型流感对人禽均有巨大威胁。现有技术中尚未见良好疗效的针对H7N9/H7N7亚型的粘膜免疫疫苗，更未有良好疗效的针对H7N9/H7N7亚型禽流感病毒的多表位粘膜免疫疫苗，面对可能的H7N9/H7N7亚型禽流感病毒的感染和流行，迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防H7亚型禽流感。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种H7亚型禽流感病毒基因工程活载体疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建：将来自于A/Anhui/01/2013 的H7N9 亚型禽流感病毒株HA（简称AH-HA）及来自于A/Netherland//03的H7N7亚型禽流感病毒毒株HA（简称NL-HA）序列合成后，引物设计在5’端引入酶切位点，在3’端引入酶切位点。PCR扩增出目的片段后，用1%琼脂糖凝胶电泳回收后用相应酶切位点进行酶切，与pGA1载体连接后转化Top10感受态；测序正确后用特用酶进行酶切，并与线性化的pAd5进行同源重组，酶切及测序正确后保存，待转染重组；（2）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救：酶切线性化重组腺病毒质粒、并转染至293细胞，定期观察有无细胞病变出现，大约在10天左右收集原代病毒液，反复冻融后传代；第2代以后的重组腺病毒感染Trex 293细胞后可以出现明显的病变，即细胞皱缩、变圆、脱落和死亡；传第3代病毒液感染293细胞，48 h后收集细胞，经western blot鉴定HA抗原均可以正确表达；从而建立携带H7亚型禽流感重组腺病毒活载体疫苗种子批毒种；（3）病毒扩增：a、采用175cm2 培养瓶，每瓶各加入107 293细胞进行培养；b、将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃ 培养90分钟，此时MOI 值约为25；c、向培养瓶加入DMEM 至30ml/瓶，再培养48-72 小时，此时有3×1011～3×1012 个病毒，若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度；（4）收集病毒颗粒：先收集培养瓶中被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM中，-20℃ /37℃ 冻融3次，离心沉淀细胞碎片，可得到病毒颗粒；（5）病毒纯化：用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒颗粒，以10000g/min 的速度离心4小时，得到H7亚型禽流感病毒基因工程活载体疫苗的原液；（6）半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，用腺病毒专用稀释液T101稀释，使携带不同H7亚型禽流感病毒HA复制缺陷型重组腺病毒达到1010vp/ml，即配制成H7亚型禽流感病毒活载体疫苗的半成品。作为本专利技术进一步的方案：步骤（2）中，病毒扩大培养后获得的是复制缺陷型携带H7亚型禽流感病毒HA的重组腺病毒，该病毒接种机体后只转录翻译表达H7亚型禽流感病毒HA蛋白及腺病毒蛋白，但不具有核酸成分，不会复制产生下一代子病毒。作为本专利技术进一步的方案：步骤（3）测定病毒滴度，采用MOI 测定。作为本专利技术进一步的方案：步骤（3）在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液。作为本专利技术进一步的方案：步骤（2）中抗原基因经过密码子优化，即选用真核细胞偏好的密码子。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术方法制备的活载体疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。附图说明图1为 H7N9/PR8AH（灭活疫苗）免疫3W SPF鸡 14d,21d,28d抗体水平（HI）。图2为rAd-HA7AH免疫3W SPF鸡14d,21d,28d抗体水平（HI）。图3为 rAd-HA7AH免疫3W SPF鸡14d,21d,28d抗体水平（HI）。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本实施例中携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA的重组腺病毒活载体疫苗毒种的制备方法，包括以下步骤：构建携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA重组腺病毒载体，转染293细胞，救获重组病毒，重组病毒的传代扩增、建立携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA的重组腺病毒主代种子批毒种，从该种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种。即：NL-HA引物设计在5’端引入应该为HindIII酶切位点，在3’端引入应该为XbaI酶切。PCR扩增出NL-HA目的片段后，用1%琼脂糖凝胶电泳回收后用Kpn I和Xho I进行酶切，与pGA1载体连接后转化Top10感受态。测序正确后用BstZ17I和SgrAI酶切，并与pAd5进行同源重组。最后Pac I酶切线性化重组腺病毒质粒并转染至293细胞，拯救成功后进行扩增。酶切线性化重组腺病毒质粒、并转染至293细胞，定期观察有无细胞病变出现，大约在10天左右收集原代病毒液，反复冻融后传代。第2代以后的重组腺病毒感染293细胞后可以出现明显的病变，即细胞皱缩、变圆、脱落和死亡。传第3代病毒液感染293细胞，48 h后收集细胞，经western blot鉴定HA抗原均可以正确表达。从而建立携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA重组腺病毒活载体疫苗种子批毒种；病毒扩增：175cm2 培养瓶中，每瓶各加入107 293 细胞进行培养。将45ml 细胞裂解液上清加入105ml DMEM混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3 次混匀，37℃ 培养90 分钟。此时MOI 值约为25。加入DMEM 至30ml/瓶。再培养48-72 小时，此时约有3×1011～3×1012 个病毒。若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度。如果要收集病毒颗粒，先收集被本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建：将来自于A/Anhui/01/2013 的H7N9 亚型禽流感病毒株HA（简称AH‑HA）及来自于A/Netherland//03的H7N7亚型禽流感病毒毒株HA（简称NL‑HA）序列合成后，引物设计在5’端引入酶切位点，在3’端引入酶切位点，PCR扩增出目的片段后，用1%琼脂糖凝胶电泳回收后用相应酶切位点进行酶切，与pGA1载体连接后转化Top10感受态；测序正确后用特用酶进行酶切，并与线性化的pAd5进行同源重组，酶切及测序正确后保存，待转染重组；（2）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救：酶切线性化重组腺病毒质粒、并转染至293细胞，定期观察有无细胞病变出现，大约在10天左右收集原代病毒液，反复冻融后传代；第2代以后的重组腺病毒感染Trex 293细胞后可以出现明显的病变，即细胞皱缩、变圆、脱落和死亡；传第3代病毒液感染293细胞，48 h后收集细胞，经western blot鉴定HA抗原均可以正确表达；从而建立携带H7亚型禽流感重组腺病毒活载体疫苗种子批毒种；（3）病毒扩增：a、采用175cm2 培养瓶，每瓶各加入107 293细胞进行培养；b、将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃ 培养90分钟，此时MOI 值约为25；c、向培养瓶加入DMEM 至30ml/瓶，再培养48‑72 小时，此时有3×1011～3×1012 个病毒，若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度；（4）收集病毒颗粒：先收集培养瓶中被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM中，‑20℃ /37℃ 冻融3次，离心沉淀细胞碎片，可得到病毒颗粒；（5）病毒纯化：用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒颗粒，以10000g/min 的速度离心4小时，得到H7亚型禽流感病毒基因工程活载体疫苗的原液；（6）半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，用腺病毒专用稀释液T101稀释，使携带不同H7亚型禽流感病毒HA复制缺陷型重组腺病毒达到1010vp/ml，即配制成H7亚型禽流感病毒活载体疫苗的半成品。...

【技术特征摘要】
1.一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建：将来自于A/Anhui/01/2013 的H7N9 亚型禽流感病毒株HA（简称AH-HA）及来自于A/Netherland//03的H7N7亚型禽流感病毒毒株HA（简称NL-HA）序列合成后，引物设计在5’端引入酶切位点，在3’端引入酶切位点，PCR扩增出目的片段后，用1%琼脂糖凝胶电泳回收后用相应酶切位点进行酶切，与pGA1载体连接后转化Top10感受态；测序正确后用特用酶进行酶切，并与线性化的pAd5进行同源重组，酶切及测序正确后保存，待转染重组；（2）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救：酶切线性化重组腺病毒质粒、并转染至293细胞，定期观察有无细胞病变出现，大约在10天左右收集原代病毒液，反复冻融后传代；第2代以后的重组腺病毒感染Trex 293细胞后可以出现明显的病变，即细胞皱缩、变圆、脱落和死亡；传第3代病毒液感染293细胞，48 h后收集细胞，经western blot鉴定HA抗原均可以正确表达；从而建立携带H7亚型禽流感重组腺病毒活载体疫苗种子批毒种；（3）病毒扩增：a、采用175cm2 培养瓶，每瓶各加入107 293细胞进行培养；b、将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃ 培养90分钟，此时MOI 值约为25；c、向培...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗琴芳，冯立强，潘蔚绮，陈凌，陈瑞爱，钟南山，
申请(专利权)人：肇庆大华农生物药品有限公司，中国科学院广州生物医药健康研究院，广州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东;44