高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法，为解决现有技术获得细胞活率低问题，包括以下步骤脂肪间充质干细胞的分离：脂肪组织用D.Hanks冲洗，并检测确保无污染，加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物，进行37℃、旋转振荡消化数十分钟后停止酶解；离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤获得的脂肪间充质干细胞悬液接种到培养瓶无血培养基中，进行原代细胞培养，培养期间多次倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；细胞培养到80‑90％融合时，用trypLETM消化后扩展接种到新培养瓶中培养，经过数次传代，得到纯化的间充质干细胞。具有消化更充分，细胞得率更高，保护间充质干细胞不受损伤，高活率的优点。

Culture method for efficiently obtaining adipose mesenchymal stem cells

The invention relates to an efficient acquisition of adipose derived mesenchymal stem cells culture method for cell survival rate is low to solve the problem of the existing technology, which comprises the following steps of adipose mesenchymal stem cells were separated with D.Hanks adipose tissue and washing, ensure that no pollution detection, adding type I collagenase and trypLETM digestive enzyme solution mixture of several body the product, 37 C, tens of minutes after the cessation of rotation and oscillation of digestive enzyme; centrifugation the supernatant was discarded; and sieving of fatty mesenchymal stem cells; adipose derived mesenchymal stem cells culture: the steps of the adipose derived mesenchymal stem cell suspension was inoculated into the culture flask no blood medium of primary cell culture, culture during times of the inverted microscope, and fresh medium; cell culture to 80 90% fusion, after digestion with trypLETM expansion After inoculation into a new culture flask, the purified mesenchymal stem cells were obtained after several passages. The invention has the advantages of better digestion, higher cell yield, protection of mesenchymal stem cells from damage and high viability.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种获取脂肪间充质干细胞方法，特别是涉及一种高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法。
技术介绍
脂肪组织在人体中大量存在，容易获取，增殖能力强，失去后对被采集者的影响较小，对受体不存在免疫反应，并且现在主动要求抽脂的人数也越来越多。因此，脂肪间充质干细胞作为一种新的成体干细胞来源有着非常广阔的前景。特别是对于中胚层来源的细胞，ADSC有着与骨髓间充质干细胞有着相近的分化能力，能向脂肪、骨、软骨、神经等细胞分化，并且从脂肪组织中分离培养间质细胞相对于从骨髓组织和密质骨组织中分离培养更易实现，因此其应用前景非常广泛。越来越多的研究显示，组织工程学在组织缺损修复中具有相当的优势，而在种子细胞的选择上也更加广泛，但哪种细胞最具有优势尚无定论。常用成体干细胞来源包括骨髓组织和脂肪组织等。脂肪组织包含有大量细胞，包括脂肪细胞、脂肪前体细胞、结缔组织细胞、干细胞、血细胞、内皮细胞、平滑肌细胞及周细胞等多种细胞。自Zuk等2001年成功从脂肪组织分离出干细胞并命名为脂肪间充质干细胞，脂肪来源的间充质干细胞得到极大关注，Zuk等人研究发现从抽脂术中获取的脂肪组织中可以分离出一种程序抽吸细胞(processed lipoaspirate(PLA)cells)，该细胞在体外培养表现出稳定的生长特性，而且在特定环境下可以向多种细胞方向分化，具有干细胞的特征。与骨髓来源的间充质干细胞相比，脂肪干细胞储量更加丰富，取材更加方便，痛苦小，干细胞扩增能力更强，而且，最近的研究证明，脂肪干细胞具有多向分化的能力，可以在不同诱导条件下成脂、成骨、成软骨分化，并能分泌血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子等。在先前的研究中，脂肪组织都是来源于抽脂术的大量液化的脂肪组织，表明皮下脂肪组织中存在具有间充质干细胞特征的细胞。现在对脂肪干细胞研究方面，在人的脂肪干细胞同一供体不同部位来源脂肪干细胞提取、扩增、细胞活性及生物学功能方面的研究未见报道。且培养方法多在用单一酶消化法，细胞得率低，消化时间长，影响细胞活性，且多数为有血清培养法，在临床转化应用脂肪间充质干细胞作为种子细胞在临床中应用，存在很大瓶颈，有许多待解决的问题：如动物源成分残留，细胞培养体系中外源病毒的引入，及细胞数量及活性生物学功能方面都存在诸多争议，没有明确的安全应用规范，这使干细胞在临床应用中受到很大的限制。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法。为实现上述目的，本专利技术高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：(1)、脂肪间充质干细胞的分离：将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染；向冲洗检验后的脂肪组织中加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物，进行37℃、旋转振荡消化数十分钟后停止酶解；离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；(2)、脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤获得的脂肪间充质干细胞悬液接种到培养瓶无血培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，培养期间多次倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化后扩展接种到新培养瓶中培养，经过数次传代，得到纯化的间充质干细胞。本专利技术将腹部、臀部等不同部位来源的自体脂肪间充质干细胞可以通过本专利技术独创的培养方法经行体外扩增培养，得到形态均一，呈成纤维样生长的干细胞群，该方法较现有方法不同之处及优点在于：(1)能确保获得高质量的脂肪间充质干细胞。(2)能使样本充分接触酶混合物，消化更充分，细胞得率更高，对细胞损伤小，能最大可能的保护间充质干细胞，不受损伤，使其具有更高活率。作为优化，在吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗前先对脂肪组织样本进行取样做无菌检测，确保样本培养过程中无污染；用trypLETM消化所用的消化液为无动物源成分消化液。作为优化，传代次数为1-6代。作为优化，将细得到纯化的间充质干细胞作为原代传代的细胞转移到细胞库中，冻存到液氮中长期保存。作为优化，冻存所用的冻存液为无动物源成分商业化冻存保护液。细胞库中的细胞均为经过细菌、真菌和人源传染性病毒检查、支原体、衣原体检查，细胞纯度鉴定、染色体核型检查，细胞生物学功能鉴定及体外动物致瘤性实验验证后均为合格的干细胞。制成的脂肪间充质干细胞培养质量控制实验主要是通过从细胞形态、活力、表型、分化潜能、细菌、真菌、内毒素、支原体衣原体、病毒等相关指标进行检测。作为优化，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织的冲洗是置离心管中离心弃去上血水，并将离心管下层的脂肪分散；进行37℃、旋转振荡消化数十分钟是37℃，350转旋转振荡消化30-45分钟；离心弃去上清夜是1500rpm离心10分钟，弃去上清液；用筛网过滤是用200目筛网过滤。作为优化，加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物是加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物。作为优化，培养期间多次倒置相差显微镜观察是分别在培养的第3、7、10天倒置相差显微镜观察。作为优化，接种到培养瓶无血培养基中是按2-4×104/cm2的密度接种到培养瓶无血培养基中，消化后扩展接种到新培养瓶中是按分种率1∶4-1∶6接种到新培养瓶中。作为优化，整个培养方法体系中均为无动物源成分包括脂肪干细胞专用培养基无血清成分，消化用混合酶无动物源成分，消化终止液无血清，冻存保护液无血清。也就是，本专利技术高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：(1)脂肪间充质干细胞的分离：无菌条件下打开样本存储装置，对脂肪组织样本进行取样做无菌检测，确保样本培养过程中无污染，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染。离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，按照相应比例加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物，37℃，350转旋转振荡消化30-45分钟后停止酶解；1500rpm离心10分钟，弃去上清夜；并用200目筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液。消化所用的消化液为无动物源成分消化液。(2)脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤(1)获得的细胞按2-4×104/cm2的密度接种到培养瓶无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，分别在培养的第3、7、10天倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，经过1-6次传代，间充质干细胞得到纯化，可以将细胞作为原代传代的细胞转移到细胞库中，冻存到液氮中长期保存。冻存所用的冻存液为无动物源成分商业化冻存保护液。所建细胞库中的细胞均为经过细菌、真菌和人源传染性病毒检查、支原体、衣原体检查，细胞纯度鉴定、染色体核型检查，细胞生物学功能鉴定及体外动物致瘤性实验验证后均为合格的干细胞。本专利技术提供了一种快捷、高效分离人脂肪间充质干细胞的方法，本专利技术能够在较短本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、脂肪间充质干细胞的分离：将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染；向冲洗检验后的脂肪组织中加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物，进行37℃、旋转振荡消化数十分钟后停止酶解；离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；(2)、脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤获得的脂肪间充质干细胞悬液接种到培养瓶无血培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，培养期间多次倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；细胞培养到80‑90％融合时，用trypLETM消化后扩展接种到新培养瓶中培养，经过数次传代，得到纯化的间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、脂肪间充质干细胞的分离：将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平板检测，确保实验前脂肪无污染；向冲洗检验后的脂肪组织中加入数倍体积的I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物，进行37℃、旋转振荡消化数十分钟后停止酶解；离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；(2)、脂肪间充质干细胞的培养：将上述步骤获得的脂肪间充质干细胞悬液接种到培养瓶无血培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，培养期间多次倒置相差显微镜观察，并更换新鲜培养基；细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化后扩展接种到新培养瓶中培养，经过数次传代，得到纯化的间充质干细胞。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于在吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗前先对脂肪组织样本进行取样做无菌检测，确保样本培养过程中无污染；用trypLETM消化所用的消化液为无动物源成分消化液。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于传代次数为1-6代。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于将得到纯化的间充质干细胞作为原代传代的细胞转移到细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶，李亚平，谷广其，邱丽媛，赵进军，何文丽，
申请(专利权)人：中卫华医北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11