制备用于局部施用的脂质体复合物的新方法及使用该脂质体复合物的抗肿瘤剂技术

本发明专利技术的目的在于，提供一种能够将活性成分有效地递送到靶细胞的新的递送方法。一种含有二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱及阳离子性脂质以及RNAi分子的脂质体复合物以及其工业制备方法。

A novel method for the preparation of liposome complexes for topical administration and antitumor agents using the same

It is an object of the present invention to provide a new delivery method capable of efficiently delivering an active ingredient to a target cell. Liposome complex containing two oil phosphatidyl ethanolamine (DOPE), phosphatidyl choline, cationic lipid and RNAi molecule and its industrial preparation method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备用于局部施用的脂质体复合物的新方法及使用该脂质体复合物的抗肿瘤剂。
技术介绍
脂质体由构成生物体的细胞膜的磷脂组成，生物相容性高，且能够在生物体内保护药物或活性成分免受分解酶等的同时进行运送，作为药物递送系统的有用工具而备受关注。另一方面，引起RNA干扰(以下，描述为“RNAi”)的RNAi分子作为用于治疗肿瘤等的有用的工具备受关注，开发了能够抑制肿瘤的增殖的各种RNAi分子。另外，开发了使用由RNAi分子和脂质混合物构成的复合物(脂质体复合物)、将作为活性成分的RNAi分子递送到肿瘤细胞的方法(非专利文献1-3)。本专利技术人等迄今为止开发了将涉及肿瘤的增殖的胸苷酸合成酶(以下，描述为“TS”)作为靶的RNAi分子(专利文献1)，报道了：使用将该RNAi分子负载于由规定的比例构成的阳离子性脂质混合物的复合体(脂质体复合物)，例如通过静脉内施用并递送至肿瘤，由此可以抑制表达TS的肿瘤的增殖，进一步通过将该脂质体复合物与化疗剂并用，可以提高对肿瘤的靶向作用，显著地提高RNAi分子引起的抗肿瘤效果(专利文献2)。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2010/113844专利文献2：WO2012/161196非专利文献非专利文献1：Qixin Leng et al.，Drug Future.2009 September；34(9)：721.非专利文献2：Sherry Y.Wu et al.，The AAPS Journal，Vol.11,No.4，December 2009.非专利文献3：B.Ozpolat et al.，Journal of Internal Medicine 267；44-53 2009.
技术实现思路
专利技术所要解决的课题在现有的脂质体复合物的制备中，制备脂质混合物的方法包括将作为构成成分的磷脂等预先溶解于氯仿或环己烷等有机溶剂的工序。但是，在利用氯仿或环己烷等有机溶剂的工业制备方法中，需要危险物操作设备或防爆装置等大规模设备。另外，目前在脂质体复合物的制备时，在医院的药剂部门中，在对癌症患者的给药前制备RNAi分子的水溶液，另外，在制备脂质混合物之后，需要将两者进行混合的繁杂的工序，需要大量劳动力。因此，本专利技术的目的在于，提供一种脂质体复合物的工业制备方法，其不需要使用大量的氯仿或环己烷等有机溶剂、进一步进行冷冻干燥之后、将生成的脂质混合物分散于水等溶剂中、与RNAi分子的水溶液等混合的繁杂的脂质体复合物制备工序，直接制备通过仅悬浮于水等溶剂而容易地生成脂质体复合物的粉末。另外，目的在于取消医院的药剂部门中的繁杂且需要大量劳动力的脂质体复合物的配制工序。用于解决课题的技术方案本专利技术人等为了解决上述课题重复进行了深入研究，结果发现：将二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱及阳离子性脂质溶解于生物相容性高、没有爆炸性的醇，一边搅拌该醇溶液一边滴加于RNAi分子的溶液中之后，将该溶液进行冷冻干燥并除去醇等溶剂，由此可以制备脂质体复合物的冷冻干燥产物。而且，将通过该方法得到的脂质体复合物的冷冻干燥产物在适当的缓冲液中混合，进行对患有癌症的靶器官的局部施用，由此可以有效地治疗该癌症患者。本专利技术基于上述见解。本专利技术如下所述。[1]一种制备脂质体复合物的方法，所述脂质体复合物含有二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱及阳离子性脂质以及RNAi分子，所述方法包括：(a)将二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱及阳离子性脂质溶解于醇中的工序；(b)在溶解有RNAi分子的溶液中在搅拌下滴加(a)中得到的醇溶液的工序；及(c)将(b)中得到的溶液进行冷冻干燥的工序，所述磷脂酰胆碱具有选自以下的(i)-(iii)中的一个以上的特征：(i)包含至少一个含有碳-碳双键的不饱和脂肪链；(ii)包含至少一个含有顺式的碳-碳双键的不饱和脂肪链；(iii)相变温度低于0℃。[2]根据[1]的方法，其中，阳离子性脂质为O,O’-双十四碳酰基-Ν-(α三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)。[3]根据[1]或[2]的方法，其中，磷脂酰胆碱为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、或1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)。[4]根据[3]的方法，其中，磷脂酰胆碱为DOPC。[5]根据[1]的方法，所述方法包括：在工序(a)中将DOPE、DOPC及DC-6-14溶解于醇中并进行混合。[6]根据[1]～[5]中任一项的方法，所述方法还包括：(d)将(c)中得到的冷冻干燥产物在缓冲液中进行混合的工序。[7]一种用于局部施用的药物组合物，所述药物组合物用于治疗胃癌、卵巢癌及胰腺癌的腹膜转移，所述药物组合物包含由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱及阳离子性脂质构成的脂质混合物和能够通过RNAi作用而抑制胸苷酸合成酶的表达的短发夹RNA(TS-shRNA)，其中，所述磷脂酰胆碱具有选自以下的(i)-(iii)中的一个以上的特征：(i)包含至少一个含有碳-碳双键的不饱和脂肪链；(ii)包含至少一个含有顺式的碳-碳双键的不饱和脂肪链；(iii)相变温度低于0℃。[8]根据[7]的药物组合物，其中，阳离子性脂质为O,O’-双十四碳酰基-Ν-(α三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)。[9]根据[7]的药物组合物，其中，磷脂酰胆碱为DOPC。[10]根据[7]的药物组合物，其中，脂质混合物由DOPE、DOPC及DC-6-14构成。[11]根据[10]的药物组合物，所述药物组合物以3：2：5的摩尔比含有DOPE、DOPC及DC-6-14。[12]根据[7]～[11]中任一项的药物组合物，其中，shRNA由以序列号8表示的碱基序列构成。[13]根据[7]～[12]中任一项的药物组合物，所述药物组合物与癌症化疗剂并用。[14]一种组合物，所述组合物含有[7]～[13]中任一项的药物组合物和癌症化疗剂。[15]根据[14]的组合物，其中，癌症化疗剂选自由具有微管蛋白的解聚抑制作用的抗肿瘤剂、脱氧胞苷衍生物及具有TS抑制作用的抗肿瘤剂构成的组。本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请号2014-221062号的公开内容。根据本专利技术，可以提供一种脂质体复合物的工业制备方法，其不需要使用大量的氯仿或环己烷等有机溶剂、进一步进行冷冻干燥之后、将生成的脂质混合物分散于水等溶剂中、与RNAi分子的水溶液等混合的繁杂的脂质体复合物制备工序，直接制备仅通过悬浮于水等溶剂而容易地生成脂质体复合物的粉末。另外，根据本专利技术，可以消除医院的药剂部门中的繁杂且需要大量劳动力的脂质体复合物的配制工序。此外，根据由本专利技术得到的脂质体复合物，可以将能够抑制肿瘤的增殖的RNAi分子有效地递送到肿瘤细胞。附图说明图1是表示在将通过现有公知的方法得到的由DOPC、DOPE及DC-6-14构成的脂质混合物溶解于有机溶剂(环己烷/乙醇(95/5(V/V)))、将得到的溶液进行冷冻干燥、使得到的干燥产物分散于水中而制作的溶液中，混合RNAi分子的水溶液而制作的制剂(现有制剂)；以及利用本专利技术方法得到的，将由DOPC、DOPE及DC-6-14构本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备脂质体复合物的方法，所述脂质体复合物含有二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱及阳离子性脂质以及RNAi分子，所述方法包括：(a)将二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱及阳离子性脂质溶解于醇中的工序；(b)在溶解有RNAi分子的溶液中在搅拌下滴加(a)中得到的醇溶液的工序；及(c)将(b)中得到的溶液进行冷冻干燥的工序，所述磷脂酰胆碱具有选自以下的(i)‑(iii)中的一个以上的特征：(i)包含至少一个含有碳‑碳双键的不饱和脂肪链；(ii)包含至少一个含有顺式的碳‑碳双键的不饱和脂肪链；(iii)相变温度低于0℃。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.30 JP 2014-2210621.一种制备脂质体复合物的方法，所述脂质体复合物含有二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱及阳离子性脂质以及RNAi分子，所述方法包括：(a)将二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、磷脂酰胆碱及阳离子性脂质溶解于醇中的工序；(b)在溶解有RNAi分子的溶液中在搅拌下滴加(a)中得到的醇溶液的工序；及(c)将(b)中得到的溶液进行冷冻干燥的工序，所述磷脂酰胆碱具有选自以下的(i)-(iii)中的一个以上的特征：(i)包含至少一个含有碳-碳双键的不饱和脂肪链；(ii)包含至少一个含有顺式的碳-碳双键的不饱和脂肪链；(iii)相变温度低于0℃。2.根据权利要求1所述的方法，其中，阳离子性脂质为O,O’-双十四碳酰基-Ν-(α三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，磷脂酰胆碱为1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、或1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)。4.根据权利要求3所述的方法，其中，磷脂酰胆碱为DOPC。5.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：在工序(a)中将DOPE、DOPC及DC-6-14溶解于醇中并进行混合。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，所述方法还包括：(d)将(c)中得到的冷冻干燥产物在缓冲液中进行混合的工序。7.一种用于局...

【专利技术属性】
技术研发人员：石田竜弘，江岛清，福岛正和，
申请(专利权)人：德尔塔菲制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP