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改良植株制造技术

技术编号:14189206 阅读:250 留言:0更新日期:2016-12-15 01:03
本发明专利技术涉及产率增加的改良植株。植株在低磷酸盐条件下显示产率增加,因此需要更少的肥料。植株的特征在于突变体磷酸盐运送蛋白基因的表达。

Improved plant

The present invention relates to improved plants with increased yield. Plants showed increased yields under low phosphate conditions, thus requiring less fertilizer. The plant is characterized by the expression of mutant phosphate transporters.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及表达核酸结构的转基因单子叶植株。
技术介绍
为了维持高产率而在农业上大量施用磷肥,这导致了严重的环境问题,人们预期非再生Pi将在70到200年内(1,2)用完,因而必需的植株大量营养元素磷酸盐(essential plant macronutrient phosphate,Pi)得到越来越多的关注。因此提高植株Pi利用率成为可持续农业生产的一个重要目标。磷是植株生长发育的一个必需大量的营养元素。缺Pi植株通常会变成暗绿色并且表现出发育不良。植株从其环境直接通过Pi运送蛋白主动吸收Pi吸收到其根部的表皮和皮层细胞而获得Pi。进入根部表层细胞后,Pi必须最终输入木质部的非原质体空间,输送到根部然后通过Pi运送蛋白在植株内重新分布。作为核酸、磷脂质以及细胞代谢的一种成分,活性细胞需要毫摩尔量量的Pi。但是,大多数的土壤Pi是固定的并且根部可吸收的Pi浓度处于微摩尔量。然而,太多的Pi摄取会导致Pi中毒症状。为了通过有限的可利用Pi协调植株生长,高亲和性Pi运送蛋白已经进化到可以使从土壤中吸收的Pi增加。植株中的高亲和性植株Pi运送蛋白最初是利用高亲和性酵母菌运送蛋白PHO84通过序列相似性被识别出来的。编码这些运送蛋白中的一些的基因能够补码PHO84酵母菌突变体。这些蛋白质属于Pi/H+协同转运子的磷酸盐运送蛋白1(PHT1)家族。拟南芥(Arabidopsis thaliana,阿拉伯芥)的九个PHT1基因已经被识别出来了,并且水稻(Oryza sativa,稻属)的13个PHT1基因也已经被识别出来了。合成蛋白质后,这些质膜(PM)蛋白质最初靶向内质网(ER),然后它们需要不同的运输步骤以到达它们的最终目的地。Pi信号路径的另一个调节器是磷酸盐运送蛋白运输促进子1(Phosphate transporter traffic facilitator 1,PHF1)(3)。这种基因编码位于ER中的蛋白质从而准确地从ER到PM靶向PHT蛋白质。OsPHF1的过表达导致转基因水稻高Pi浓度时Pi积累增加。但是,在拟南芥中,AtPHF1的过表达没有导致Pi(4,5)摄取量显著增加。因而,虽然PHF活性增加导致从ER到PM的PHT易位,这没有导致拟南芥Pi摄取量增加。在拟南芥中,人们研究了AtPHT1;1的突变,它在分别模拟非磷酸化或磷酸化残基的多个磷酸化位点具有突变。AtPHT1;1的野生型和突变型在拟南芥中得以表达。有人提出PHT1;1的C-终端发生的磷酸化作用和防止PHT1;1从ER离开有关。另外一方面,研究表明AtPHT1;1的非磷酸化突变没有影响PM(5)中PHT1;1的降解和稳定性过程。磷酸化位点也在水稻AtPHT1;1和OsPHT1;8(OsPT8)(4)同系物中得以识别。OsPT8和水稻的磷酸盐内稳态相关。水稻OsPT8增强基因表达强化了的Pi摄取并且过表达植株表现出生长减缓(9)。因此,也有结果证明Pi摄取量增加不一定产生有益的表型:OsPT2和OsPT8的过表达导致过量的芽Pi积累并且产生Pi中毒表型,和OsPHR2(9)过表达相似。本专利技术旨在为植株提供在低外部Pi浓度下增加Pi摄取和提高产率的有益表型。因此,这样的植株需要更少的磷肥以维持更高的产率并且得以解决农业上减少磷肥的需要。附图说明本专利技术通过下列非限制性附图描述。附图1 CK2β3直接和PT相互作用并且对于CK3和PT的相互作用是必须的。(A)酵母菌双杂交试验表明在四个CK2亚单元(α2、α3、β1和β3)中只有CK2β3和酵母菌细胞的PT2以及PT8相互作用。EV,空载体;SD/LW,-Leu(亮氨酸)-Trp(色氨酸);SD/LWHA,-Leu(亮氨酸)-Trp(色氨酸)-His(组氨酸)-Ade(腺嘌呤);+阳性对照(NubI)。(B)用PT2&8(PT2-CT&PT8-CT)CK2α3和CK2β3高度保守的羧基终端胜肽做体内免疫共沉淀试验。蛋白质从表达PT2-CT-GFP(绿色荧光蛋白)或PT8-CT-GFP(绿色荧光蛋白),和CK2α3-FLAG或CK2β3-MYC的农杆菌渗入的烟草植株中提取。(输入)利用反-GFP(绿色荧光蛋白)免疫沉淀(IP)并且免疫印迹利用特定标签的抗体制作。(C)在酵母菌三杂交试验(Y3H)中,CK2β3是CK2α3与PT2-CT和PT8-CT相互作用所必需的。SD/LMW,-Leu(亮氨酸)-Met(蛋氨酸)-Trp(色氨酸);SD(变相分离)/LMWH,-Leu(亮氨酸)-Met(蛋氨酸)-Trp(色氨酸)-His(组氨酸);EV,空载体。(D)体内PT8–CT,CK2α3和CK2β3的免疫共沉淀。从在指示组合(输入)中表达GFP(绿色荧光蛋白)(对照),CK2α3-FLAG,PT8-CT-GFP(绿色荧光蛋白)和CK2β3-MYC的农杆菌渗入的烟草植株中提取的蛋白质利用反-GFP(绿色荧光蛋白)免疫沉淀(IP)并且免疫印迹利用特异性标签的抗体制作。(E)包括单独(左边)包含PT8-GFP(绿色荧光蛋白)结构或同时包含CK2α3(中间)或CK2β3过表达结构(右边)在7天大转基因植株的水稻根部的表皮细胞里进行PT8-GFP(绿色荧光蛋白)(PT8p-PT8-GFP(绿色荧光蛋白))亚细胞定位的共焦分析。条形长度=20μm。附图2 CK2α3调整PT8和CK2α3的磷酸化作用与CK2β3相互作用取决于细胞Pi状态并且会削弱PT8和PHF1的相互作用。(A)体内PT8利用CK2α3的磷酸化作用。在野生型(wt)和CK2α3-过表达(Oxα3)植株里而非CK2α3-基因沉默(Ria3)植株(上部)里观察到更低的迁移带。这些带对λ-磷酸酶处理(λ-PPase)(下部)敏感。这些免疫印迹利用反-PT8在磷标记的的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)制作。(B)细胞Pi依赖型磷酸化作用和CK2β3的λ-PPase敏感性。非磷酸化的CK2β3也可利用P还原。考马斯亮蓝(CBB)染色用作总体蛋白质的加载对照。(C)CK2β3和CK2α3之间相互作用的细胞Pi敏感性。β3-FLAG蛋白质分别从+Pi或–Pi条件下生长的转基因植株纯化得到,并且GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-α3在E.coli(大肠杆菌)内纯化得到,然后做GST(谷胱甘肽巯基转移酶)下拉试验。这个实验利用在+P和-P提取物(50ng)中相似量的CK2β3进行。β3-FLAG(家禽抗小鼠淋巴细胞球蛋白)/GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-α3蛋白质是通过免疫标记利用反-GST(谷胱甘肽S转移酶)或反-FALG(家禽抗小鼠淋巴细胞球蛋白)抗体检测出来。纯化后的GST-α3和β3FALG(家禽抗小鼠淋巴细胞球蛋白)蛋白质在输入泳道上加载。(D)基于下拉试验PHF1在体外没有和磷酸化的PT8相互作用。如图所示的是包含已消退并且亲和纯化了结合反应的蛋白免疫印迹的西方墨点法的凝胶,所述结合反应包含了PHF1-MYC(原癌基因)(上板),GST(谷胱甘肽巯基转移酶)(阴性对照),GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-PT8-CTS517和GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-PT8-CTS517A(底部)。CK2本文档来自技高网...
<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/27/201480058617.html" title="改良植株原文来自X技术">改良植株</a>

【技术保护点】
一种表达核酸结构的转基因单子叶植株,所述核酸结构包括编码突变PT多肽的核酸序列,所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.25 CN 201310513975X1.一种表达核酸结构的转基因单子叶植株,所述核酸结构包括编码突变PT多肽的核酸序列,所述突变PT多肽含有如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体的或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。2.根据权利要求1所述的转基因单子叶植株,其中所述修饰为丝氨酸残基的取代。3.一种根据权利要求2所述的转基因单子叶植株,其中所述取代是用丙氨酸。4.一种根据前述权利要求中任一的转基因单子叶植株,其中所述植株选自于水稻、小麦、大麦、高粱和玉米。5.一种根据前述权利要求中任一的转基因单子叶植株,其中所述突变PT多肽为SEQ ID No.2的同系物并且在对应位置上包含氨基酸修饰。6.一种根据权利要求5所述的转基因单子叶植株,其中所述同系物序列具有和SEQ ID No.2至少80%,至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或99%的一致性。7.一种根据前述权利要求的转基因单子叶植株,其中所述变体或同源序列为单子叶植株PT。8.一种根据权利要求1到3中任一的转基因单子叶植株,其中所述突变PT多肽包括SEQ ID No.2但其中在SEQ ID No.2部位517的丝氨酸被取代。9.一种根据权利要求8所述的转基因单子叶植株,其中所述植株为水稻。10.一种根据前述权利要求的转基因单子叶植株,其中所述核酸结构进一步包括调控序列。11.一种根据权利要求1到10中任一项定义的植株或它们的一部分衍生的产品。12.一种编码突变植株PT多肽的分离核酸,所述突变PT多肽包括如在SEQ ID No.2所示的部位S517上的氨基酸修饰或在SEQ ID No.2的功能性变体或同源于SEQ ID No.2的序列的对应位置上的丝氨酸的氨基酸修饰,其中所述植株为单子叶植株。13.一种根据权利要求12所述的分离核酸,其中所述修饰为氨基酸的取代。14.一种根据权利要求13所述的分离核酸,其中所述取代是用丙氨酸。15.一种根据权利要求12到14中任一的分离核酸,其中所述突变PT多肽为SEQ ID No.2的同系物并且包括如在对应于SEQ ID No.2所示的部位S517的位置上的丝氨酸的氨基酸修饰。16.一种根据权利要求15所述的分离核酸,其中所述同系物序列具有和SEQ ID No.2至少80%,至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或99%的一致性。17.一种根据权利要求12到16中任一的分离核酸,其中所述同系物选自于从小麦、大麦、高粱和玉米。18.一种根据权利要求12的分离核酸,其编码基本上如SEQ ID No.2所示的多肽,然而其中SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员:P吴J陈
申请(专利权)人:浙江大学
类型:发明
国别省市:浙江;33

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