最优大豆座位制造技术

如本申请公开的，鉴定了大豆植物的最优天然基因组座位，它们代表了外源序列靶向插入的最佳位点。

Optimal soybean seat

If this application is disclosed, the optimal natural genomic loci of soybean plants have been identified, which represent the optimal site for the insertion of foreign sequences.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉援引本申请要求享受2013年11月4日递交的美国临时专利申请第61/899,602号在35U.S.C.§119(e)下的权益，将上述申请的内容全部通过并入本申请。对电子提交的序列表的援引序列表的正式拷贝作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web电子递交，文件名为“75608232324seqlist.txt”，于2014年11月3日提交，大小为13.4兆字节，与说明书同时提交。该ASCII格式文档中包含的序列表是说明书的一部分，在此通过提述将其全文并入本申请。对电子提交的表格列表的援引表格列表的正式拷贝以.PDF格式的表格列表的形式通过EFS-Web电子提交，文件名为“Table3”，于2014年11月3日生成，大小为11.6兆字节，与说明书同时提交。该.PDF格式文档中包含的序列表是说明书的一部分，在此通过提述将其全文并入本申请。背景人们在1990年代早期即已成功地用转基因转化了多种类型的双子叶植物(例如大豆植物)的基因组。在过去的二十年内，人们已经开发了多种用于转化双子叶植物(如大豆)的基因组的方法学，其中转基因被稳定地整合到双子叶植物的基因组中。双子叶植物转化方法学的这种演变的结果是人们有能力成功地将包含农艺性状的转基因导入双子叶植物，例如大豆的基因组内。在1990年代晚期实现的双子叶植物内昆虫抗性和除草剂耐受性状的导入为生产者提供了一项新颖而方便的技术革新用于控制昆虫和广谱的杂草，这当时在种植农业方法中是无可匹敌的。目前，转基因双子叶植物在全世界都有市售，且新的转基因产品，例如EnlistTM大豆，为日益严峻的杂草挑战提供了改进的解决方案。若非有转基因方法学的研发和改进，转基因双子叶植物在现代农艺学实践中的利用是不可能的。然而，现有的转基因方法学依赖转基因在双子叶植物，例如大豆基因组中的随机插入。依赖基因在基因组中的随机插入有若干不利之处。转基因事件可能随机地整合在基因转录序列中，进而破坏内源性状的表达并改变植物的生长和发育。此外，转基因事件可能无差别地整合到基因组中容易受到基因沉默的位置内，以第一代或后续世代的转基因植物中转基因表达的减少或完全抑制告终。最后，转基因在植物基因组内的随机整合需要可观的工作量和成本来鉴定转基因事件的位置并选择如设计的那样表现、不对植物产生农艺学影响的转基因事件。需要持续开发新的测定法来为每种转基因事件，例如大豆转基因事件，确定整合的转基因的确切位置。植物转化方法学的随机性导致整合的转基因的“位置效应”，阻碍了转化方法学的有效性和效率。植物的靶向基因组修饰已经成为应用研究和基础研究的一个长期未能达到且难以达到的目标。将基因和基因堆叠靶向到双子叶植物植物(例如玉米植物)基因组中的特定位置将会改善转基因事件的质量，降低产生转基因事件的相关成本，并提供制造转基因植物产品的新方法，例如顺序性基因堆叠。总的来说，将转基因靶向特定基因组位点很可能是商业上有利的。过去几年中，用于通过位点特异性核酸酶(例如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALENS)、以及成簇规则间隔短回文重复/CRISPR-相关核酸酶(CRISPR/Cas)结合工程化crRNA/tracr RNA)靶向和切割基因组DNA，以诱导靶向突变、诱导细胞DNA的靶向删除、以及易化外源供体DNA多核苷酸在预定的基因组座位内的靶向重组的方法和组合物的开发已经取得了显著的进展。参见例如，美国专利公开号20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；和20060188987，和国际专利公开号WO2007/014275，将它们的公开通过提述并入本申请用于所有目的。美国专利公开号20080182332描述了非经典锌指核酸酶(ZFN)用于植物基因组的靶向修饰的用途，美国专利公开号20090205083描述了植物EPSP基因组座位的ZFN介导的靶向修饰。现有的外源DNA靶向插入的方法涉及用含有至少一种转基因的供体DNA多核苷酸与位点特异性核酸酶(例如ZFN)共转化植物组织，其中位点特异性核酸酶设计为结合并切割活跃转录的编码序列的特定基因组座位。这导致供体DNA多核苷酸稳定地插入被切割的基因组座位内，结果实现在包含活跃转录的编码序列的规定基因组座位处的靶向基因添加。一种替代的途径是将转基因靶向到双子叶植物如大豆的预先选择的靶标非基因座位。近年来，已经开发出数种将转基因靶向投递到双子叶植物(例如大豆)的基因组中的技术，并在植物细胞中加以应用。然而，关于适合靶向的基因组位点的属性则知之甚少。过去历来用基因组中的非关键基因及病原体(病毒)整合位点作为靶向的座位。此类位点在基因组中的数目相当有限，因此有需要鉴定和表征能够用于靶向供体多核苷酸序列的最优可靶向基因组座位。除了易于靶向之外，预期最优基因组座位是中性位点，能够支持转基因表达和育种应用。需要组合物和方法来界定双子叶植物植物(例如大豆植物)基因组内供靶向转基因整合用的最优非基因座位的鉴定标准。概要在一个实施方案中，本公开涉及一种重组序列，其包含：至少有1Kb、并且与选自soy_OGL_1423(SEQ ID NO：639)，soy_OGL_1434(SEQ ID NO：137)，soy_OGL_4625(SEQ ID NO：76)，soy_OGL_6362(SEQ ID NO：440)，soy_OGL_308(SEQ ID NO：43)，soy_OGL_307(SEQ ID NO：566)，soy_OGL_310(SEQ ID NO：4236)，soy_OGL_684(SEQ ID NO：47)，soy_OGL_682(SEQ ID NO：2101)和soy_OGL_685(SEQ ID NO：48)的非基因序列有至少90％、95％或99％序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中，感兴趣的DNA的插入通过改变邻近插入位点的非基因座位序列(包括例如非基因座位序列的缺失、倒位、插入和重复)而修饰非基因座位的原始序列。在另一个方面中，实施方案涉及感兴趣的DNA，其中该感兴趣的DNA插入所述非基因序列中。在另一个方面中，实施方案包括所述重组序列，其中感兴趣的DNA插入锌指靶位点的邻近处。在另一个方面，实施方案包括所述重组序列，其中感兴趣的DNA插入在锌指靶位点处。在另一个实施方案中，所述重组序列包含插入的感兴趣DNA，该感兴趣的DNA还包含分析域。在另一个实施方案中，所述重组序列包含插入的感兴趣DNA，该感兴趣的DNA不编码肽。在又一个实施方案中，所述重组序列包含插入的感兴趣DNA，该感兴趣的DNA编码肽。在又一个实施方案中，所述重组序列包含插入的感兴趣DNA，该感兴趣的DNA还包含基因表达盒。在一个实施方案中，所述基因表达盒含有基因，包括杀虫剂抗性基因、除草剂耐性基因、氮利用效率基因、水分利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因和选择标志物基因。在进一步的一个实施方案中，所述重组序列包含两个或多个基因表达盒。在另一个实施方案中，所述重组序列包含位于相同染色体上的两个或更多个所述非基因序列。在进一步的一个实施方案中，所述重组序列包含所述感兴趣的DNA，和/或所述非基因序列在所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组序列，该重组序列包含：至少1Kb的核酸序列，该序列与选自下组的非基因序列有至少90％序列同一性：soy_OGL_1423(SEQ ID NO:639),soy_OGL_1434(SEQ ID NO:137),soy_OGL_4625(SEQ ID NO:76),soy_OGL_6362(SEQ ID NO:440),soy_OGL_308(SEQ ID NO:43),soy_OGL_307(SEQ ID NO:566),soy_OGL_310(SEQ ID NO:4236),soy_OGL_684(SEQ ID NO:47),soy_OGL_682(SEQ ID NO:2101),soy_OGL_685(SEQ ID NO:48),和感兴趣的DNA，其中该感兴趣的DNA插入所述非基因序列中而产生所述重组序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.04 US 61/899,6021.一种重组序列，该重组序列包含：至少1Kb的核酸序列，该序列与选自下组的非基因序列有至少90％序列同一性：soy_OGL_1423(SEQ ID NO:639),soy_OGL_1434(SEQ ID NO:137),soy_OGL_4625(SEQ ID NO:76),soy_OGL_6362(SEQ ID NO:440),soy_OGL_308(SEQ ID NO:43),soy_OGL_307(SEQ ID NO:566),soy_OGL_310(SEQ ID NO:4236),soy_OGL_684(SEQ ID NO:47),soy_OGL_682(SEQ ID NO:2101),soy_OGL_685(SEQ ID NO:48),和感兴趣的DNA，其中该感兴趣的DNA插入所述非基因序列中而产生所述重组序列。2.权利要求1的重组序列，其中所述感兴趣的DNA插入在锌指靶位点邻近。3.权利要求1的重组序列，其中所述感兴趣的DNA插入在成对的锌指靶位点之间。4.权利要求1的重组序列，其中所述感兴趣的DNA包含分析域。5.权利要求1的重组序列，其中所述感兴趣的DNA不编码肽。6.权利要求1的重组序列，其中所述感兴趣的DNA编码肽。7.权利要求1的重组序列，其中所述感兴趣的DNA包含基因表达盒，所述基因表达盒包含杀虫剂抗性基因、除草剂耐性基因、氮利用效率基因、水分利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因和选择标志物基因。8.权利要求1的重组序列，其中所述感兴趣的DNA包含两个或多个基因表达盒。9.权利要求1的重组序列，其中两个或更多个所述非基因序列各自包含插入的感兴趣的DNA，从而产生两个或更多个重组序列，其中所述两个或更多个重组序列位于相同染色体上。10.权利要求1的重组序列，其中在所述感兴趣的DNA插入所述非基因序列的过程中所述感兴趣的DNA和/或所述非基因序列被修饰。11.权利要求1-10中任一项的重组序列，其中所述非基因大豆基因组座位与选自下组的序列有至少90％序列同一性：soy_OGL_1423(SEQ ID NO:639),soy_OGL_1434(SEQ ID NO:137),soy_OGL_4625(SEQ ID NO:76),soy_OGL_6362(SEQ ID NO:440),soy_OGL_308(SEQ ID NO:43),soy_OGL_307(SEQ ID NO:566),和soy_OGL_310(SEQ ID NO:4236)。12.权利要求1-10中任一项的重组序列，其中所述非基因大豆基因组座位与选自下组的序列有至少90％序列同一性：soy_OGL_308(SEQ ID NO:43),soy_OGL_307(SEQ ID NO:566),和soy_OGL_310(SEQ ID NO:4236)。13.包含权利要求1-10中任一项的重组序列的大豆植物、大豆植物部分、或大豆植物细胞。14.一种制造转基因植物细胞的方法，所述转基因植物细胞包含感兴趣的DNA，该方法包括：a.从下组中选择具有至少90％序列同一性的靶非基因大豆基因组座位：soy_OGL_1423(SEQ ID NO:639),soy_OGL_1434(SEQ ID NO:137),soy_OGL_4625(SEQ ID NO:76),soy_OGL_6362(SEQ ID NO:440),soy_OGL_308(SEQ ID NO:43),soy_OGL_307(SEQ ID NO:566),soy_OGL_310(SEQ ID NO:4236),soy_OGL_684(SEQ ID NO:47),soy_OGL_682(SEQ ID NO:2101),和soy_OGL_685(SEQ ID NO:48)；b.选择特异性结合并切割所述靶非基因大豆基因组座位的位点特异性核酸酶；c.将所述位点特异性核酸酶导入大豆植物细胞；d.将所述感兴趣的DNA导入该植物细胞；e.将该感兴趣的DNA导入所述靶非基因大豆基因组座位；和f.选择包含被靶向到所述非基因座位的感兴趣的DNA的转基因植物细胞。15.权利要求14的制造转基因植物细胞的方法，其中所述感兴趣的DNA包含分析域。16.权利要求14的制造转基因植物细胞的方法，其中所述感兴趣的DNA不编码肽。17.权利要求14的制造转基因植物细胞的方法，其中所述感兴趣的DNA编码肽。18.权利要求14的制造转基因植物细胞的方法，所述感兴趣的DNA包含基因表达盒，所述基因表达盒包含转基因。19.权利要求14的制造转基因植物细胞的方法，其中所述感兴趣的DNA包含两个或更多个基因表达盒。20.权利要求14的制造转基因植物细胞的方法，其中所述位点特异性核酸酶选自下组：锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALEN、归巢核酸酶、或大范围核酸酶。21.权利要求14的制造转基因植物细胞的方法，其中所述感兴趣的DNA通过同源性指导修复整合法整合到所述非基因座位内。22.权利要求14的制造转基因植物细胞的方法，其中所述感兴趣的DNA通过非同源末端连接整合法整合到所述非基因座位内。23.权利要求14的制造转基因植物细胞的方法，其中两个或更多个所述感兴趣的DNA插入到两个或更多个所述靶非基因大豆基因组座位中。24.权利要求23的制造转基因植物...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·萨斯特里登特，Z·曹，S·斯里拉姆，S·R·韦布，D·L·坎珀，M·W·安利，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国;US