用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子遗传学，提供了用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记及其应用，该组遗传标记由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026，发明专利技术人提供了上述8个微卫星位点的引物。并利用该引物获得荧光标记引物进行荧光标记毛细管电泳，并，用Gene Mapper V3.0软件结合Gene Marker软件V1.75进行基因型判定，用Cervus3.0软件进行亲缘关系鉴定，并建立了应用试剂盒；可用于奶牛系谱鉴定和构建，为提高奶牛选种育种的准确性奠定重要的基石，可促进奶牛的育种进程，具有良好的应用前景和经济效益。

Genetic markers for the construction and identification of molecular families of dairy cows and uses thereof

The present invention relates to molecular genetics, genetic markers for the identification and construction of cow molecular genealogy and its application provides the set of genetic markers by 8 loci, respectively TGLA227, TGLA122, BMC1207, BM103, INRA037, INRA134, BP7 and MB026, the invention provides the primers of 8 microsatellite loci. And using the primers obtained fluorescent labeled primers were labeled by capillary electrophoresis, and genotypes were determined by Gene Mapper V3.0 software combined with Gene Marker software V1.75, the genetic relationship was identified by Cervus3.0 software, and the establishment of the application kit; can be used for the construction of cow identification and pedigree, lay an important foundation for improving accuracy cow breeding, can promote the breeding process of dairy cows, and has a good application prospect and economic benefit.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子遗传学，提供了一组用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记及其应用。
技术介绍
对奶牛进行遗传改良工作需要进行种公牛后裔测定和奶牛分子标记辅助选择等几个方面的工作，而系谱记录的准确性对于奶牛的遗传改良至关重要。部分中小型奶牛场管理不严格导致奶牛系谱缺乏，或是由于人工授精技术的普及及生产环节(系谱记录)中不可避免的错误，导致牛群系谱记录不全或错误，所以奶牛分子系谱构建及系谱准确率评估成了遗传改良中的重要一环。微卫星标记技术是比较成熟的亲缘关系鉴定工具，且具有成本低，可靠性高，方便使用等优点。贾名威等(2004)利用6个微卫星位点对2头确定母女关系的荷斯坦母牛和5头可疑父种公牛进行了亲权鉴定。钟美明等(2010)利用15个微卫星标记进行多重PCR扩增，对350头荷斯坦奶牛和35头种公牛进行了亲缘关系鉴定。微卫星位点与其它的遗传标记相比，更适宜用于人的亲权鉴定、家畜的系谱构建或鉴定提供了独到的优势。因为其具有以下优点：(1)微卫星标记广泛分布于真核生物基因组中，且多态性高，具有较高的多态信息含量(polymorphism information content,PIC)，由于大部分微卫星位点位于非编码区，基本不受自然选择和人工选择的影响，是一种中性标记。另一方面微卫星标记的遗传遵循孟德尔遗传定律，是一种共显性标记，易于区分纯合子和杂合子。等位基因数目多，SSR位点的杂合度较高；(2)STR标记遗传稳定性好，突变率低，仅为10-4；(3)STR标记具有种间保守性，使得部分微卫星位点具有种间通用性，且SSR位点具有个体间高度特异性，两个个体具有同一位点的概率为10-4；(4)微卫星位点检测试验操作简便，可通过PCR扩增及电泳分析完成检测。并且微卫星位点检测对DNA模板需求量低，部分降解DNA也可用于微卫星位点的检测。目前已有针对荷斯坦奶牛的微卫星亲权鉴定方法与对应的分子标记，虽然有部分技术公开了一些相关内容，但是由于品种或群体之间的不同，基本没有参考价值且其公开的分子标记较多，依然存在一定弊端，如微卫星位点的使用数量较多，操作方法比较繁琐，使用成本比较高，且不适用于生产实践中奶牛场中常见的少量或个别系谱记录错误或缺失个体间的亲子鉴定。因此，亟需要一种分子标记使用数目少、试验操作简便、系谱鉴定准确度高且成本较低的亲子鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人在上述技术背景下，植根于奶牛牛群，旨在优化用于奶牛分子系谱构建的微卫星标记组合，所选择的微卫星遗传标记由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026，专利技术人提供了上述8个微卫星位点的引物。并利用该引物获得荧光标记引物进行荧光标记毛细管电泳，并用Gene Mapper V3.0软件结合Gene Marker软件进行基因型判定和亲缘关系鉴定；可用于奶牛系谱鉴定，可提高奶牛育种准确性，加快奶牛的育种进程，具有良好的应用前景和经济效益，同时优化微卫星组合使得检测成本降低。本专利技术所提供的微卫星标记，由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026；8个位点的基本信息如下表所示：上述引物序列的核苷酸序列如SEQ NO.1-16所示；在选取上述8个位点之后，专利技术人进一步提供了用于奶牛亲缘关系鉴定及分子系谱构建的PCR检测试剂盒，所述试剂盒含有用于PCR扩增上述微卫星位点的荧光PCR引物。更进一步的，专利技术人提供了上述微卫星标记在奶牛亲缘关系鉴定、分子系谱构建及系谱准确率评估中的应用。其具体是以待测奶牛的基因组DNA为模板，利用单重荧光PCR扩增和毛细管电泳技术结合进行基因型检测，具体步骤为：(1)DNA提取：奶牛血液、精液或毛囊样品基因组DNA提取；(2)荧光标记PCR扩增：根据8个微卫星位点设计荧光标记引物(上表中对应上游引物F5’端FAM标签标记的荧光引物)，以基因组DNA为模板进行PCR扩增；除采用荧光标记除FAM外还可以采用HEX、TAMRA等，表1 荧光标记引物8个位点的最优PCR扩增体系和PCR反应程序：以15μl扩增体系为例，PCR扩增的反应体系见表2。表2 PCR扩增体系PCR反应条件见表3。表3 PCR反应条件(3)基因分型：进行荧光标记毛细管电泳，并用Gene Mapper V3.0软件结合Gene Marker软件进行基因型判定。基于上述技术，本专利技术所提供的技术还可以在奶牛亲缘关系准确率评估中的有所应用，具体可参考上述方法。综上所述，本专利技术针对奶牛牛群的特点，筛选出一组适用于奶牛亲权鉴定的微卫星标记，共包括8个微卫星位点，这8个位点多态性高、标记间不连锁，易于进行检测。利用8个微卫星位点组合进行奶牛亲权鉴定，在三种情况下的结合排除概率CPE-1、CPE-2和CPE-3分别为0.990、0.999和0.999，均达到99％的排除概率，检测效率极高。本专利技术利用单重荧光PCR和毛细管电泳技术，建立了基于上述8个微卫星位点准确高效的基因分型方法，可用于奶牛系谱鉴定，可提高奶牛育种准确性，加快奶牛的育种进程，具有良好的应用前景和经济效益，同时优化微卫星组合使得检测成本降低。具体实施方式实施例1.微卫星位点的选择及确定1、本专利技术所提供的微卫星标记，由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026；8个位点的基本信息如下表4所示：表4 位点的基本信息上述引物序列的核苷酸序列如SEQ NO.1-16所示；2、微卫星位点基因型检测采用单重荧光PCR结合ABI3730自动测序仪荧光电泳技术对300头奶牛和9头种公牛8个位点的PCR产物进行基因型检测。将荧光标记的PCR扩增产物进行毛细管电泳，并用ABI3730测序仪检测基因型峰值并用Gene Mapper V3.0软件结合Gene Marker V1.75软件进行微卫星基因型判定。3、微卫星位点的遗传多态性分析应用CERVUS3.0软件对基因型数据进行处理，计算微卫星位点的各个遗传参数，包括等位基因数、等位基因频率、多态信息含量、期望杂合度、观察杂合度、排除概率等。等位基因及等位基因频率如表5。同时运用Excel表格和公式计算了每个微卫星位点的有效等位基因数，统计结果如表6所示。8个微卫星位点均表现出较多的等位基因数目，其中TGLA227、TGLA122、BMC1207和INRA134等位基因数目分别为19、19、18、19，表现出很高的多态性；INRA037、BM103和MB026三个位点的等位基因数目为13、11和11，均大于10，表现出较高的多态性，微卫星位点BP7等位基因数目最少，为7个，多态性较低。这8个微卫星位点的平均等位基因数为14.63，平均等位基因数较高。有效等位基因数目同样是反映群体遗传变异大小的一个测定指标，有效等位基因是各位点等位基因频率平方和的倒数，由表6可看出，8个微卫星位点的有效等位基因个数与等位基因个数相对比，数目较少，这表明该微卫星位点等位基因在群体中分布不均匀，比如微卫星位点INRA134等位基因数目为19个，但有效等位本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记，其特征在于：该遗传标记为微卫星标记，由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026；8个位点的基本信息如下表所示：上述引物序列的核苷酸序列如SEQ NO.1‑16所示。

【技术特征摘要】
1.用于构建和鉴定奶牛分子系谱的遗传标记，其特征在于：该遗传标记为微卫星标记，由8个位点组成，分别为TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026；8个位点的基本信息如下表所示：上述引物序列的核苷酸序列如SEQ NO.1-16所示。2.权利要求1所述遗传标记在奶牛亲缘关系鉴定、分子系谱构建及系谱准确率评估中的应用，其特征在于：以待测奶牛的基因组DNA为模板，利用单重荧光PCR扩增和毛细管电泳技术结合进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：师科荣，王中华，殷彬，岳书俭，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37