一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法，本发明专利技术的一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗含有A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物，以及B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白(fHBP)A亚族和B亚族两个亚家族的重组蛋白，本发明专利技术还提供了重组fHBP‑A和fHBP‑B蛋白的制备方法，本发明专利技术的联合疫苗用于2岁以上儿童的免疫，用于预防由A群或B群或C群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎、菌血症、肺炎及心包炎等侵袭性疾病，提供对脑膜炎球菌更好、更广泛的保护作用。

Group ABC meningococcal combined vaccine and preparation method thereof

The invention provides a ABC meningococcal vaccine and its preparation method, a meningococcal ABC combined vaccine containing A group and C group meningococcal polysaccharide protein conjugates of the invention, and B meningococcal H factor binding protein (fHBP) recombinant protein A subfamily and B subfamily two subfamily. The invention also provides a method for preparing recombinant fHBP A and fHBP B protein, the invention of the combined vaccine for immunization in children over 2 years old, for the prevention of A caused by group or group B or group C meningococcal meningitis, bacteremia, the lung inflammation and pericarditis invasive disease, to provide protection the role of meningococcal better and more widely.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种疫苗的制备，特别涉及一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法，所述ABC群脑膜炎球菌联合疫苗包括A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白(fHBP)A和B亚族两种重组蛋白混合配制而成的联合疫苗制剂及其制备方法。
技术介绍
1流行性脑脊髓膜炎分类及流行情况：流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)，是由脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitides,NM)感染引起的以脑脊髓膜炎和菌血症为主的呼吸道传染病。目前以婴幼儿发病为主，呈地方性流行、暴发、散发形式，NM引起的侵袭性疾病有脑膜炎、菌血症和肺炎等，病死率约为12％～20％，幸存者中有11％～19％留有后遗症。脑膜炎奈瑟菌根据荚膜多糖的结构特征分为12个血清群，无法分群的脑膜炎奈瑟菌统称为不可分群菌株(nongroupable,NG)，大多为健康人群携带，较少引起致病。根据外膜蛋白PorB和PorA的特征，脑膜炎球菌进而分为不同的血清型和血清亚型。通过多基因位点序列分型(multi locus sequence typing,MLST)，脑膜炎奈瑟菌可分为不同的序列型(sequence type,ST)，不同的ST菌株聚类为不同的克隆群(clonal complex,cc)。流脑有95％的病例由A、B、C、Y和W135群引起,而以A、B、C群菌致病更高达90％以上。随着时间的推移和疫苗的应用，流脑流行的优势血清群经常发生变迁，美国经历了由A群至B群，又转至C、Y群的过程，目前Y、B、C群引起的病例约各占1/3；欧洲以C群为主，但目前B群流脑病例已占45～80％；非洲以A群为主，而近年也出现C群、W135群引起的病例。中国一直以A群Nm引起的流脑为主，B群、C群只引起散发病例。近10年来，中国流脑流行菌群的分布出现了明显变化，自2004～2005年安徽省出现C群流脑的爆发以来，中国流脑病例中C群所占比例逐年增多，C群逐渐成为流脑主要流行菌株。而根据流脑数据监测，近期由B群引起的流脑病例也显著增加，由B群流脑引起婴幼儿死亡的病例时见报道，并且B群菌株呈现ST4821克隆群克隆化趋势。当前我国C群 菌株优势菌群为ST-4821cc，因此揭示出，我国ST-4821克隆群C群和B群菌株之间发生了血清群转换。2流脑疫苗的应用效果：流脑疫苗的应用对于控制流脑的流行起到关键作用。A群流脑多糖疫苗于1980年研制成功，注射后反应轻微，保护效果>90％；A+C脑膜炎球菌多糖疫苗于2000年研制成功上市，ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗于2006年研制成功上市。A+C多糖蛋白结合疫苗于2006年研制成功上市，A+C群脑膜炎球菌(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗于2014年研发成功上市。多糖疫苗和多糖蛋白结合疫苗的应用，有效的降低了脑脊髓膜炎的发病率。对A，C，W 135和Y群脑膜炎奈瑟菌起到了预防和治疗作用。然而，由于B群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖免疫原性弱，加之包含的表位和人体组织的唾液酰基蛋白存在交叉反应，而不能被作为疫苗成份。因此，B群脑膜炎球菌疫苗研发集中在有效的蛋白成份上。B群外膜蛋白(out membrane protein,OMP)或被称为外膜囊泡疫苗(out membrane vesicle,OMV)，为目前研制与应用较为广泛的疫苗，主要有古巴单价VA-MENGOC-BC疫苗、新西兰MeNZBTM疫苗及挪威MenBvac疫苗，研究发现外膜蛋白疫苗诱导的抗体只能针对相应的菌株，鉴于B群流脑遗传学的多样性，因此单价OMV疫苗是不可能保护和抵抗所有不同B群流脑菌株所导致的疾病。3 B群流脑疫苗的研发方向目前B群流脑疫苗研发工作最为深入的方向之一即为重组膜蛋白疫苗。脑膜炎球菌基因组学和蛋白质组学的发展，提供了更多的鉴别筛选新疫苗抗原分子的方法和可能。反向疫苗学已经成为一门新的学科，通过采用计算机对细菌基因组进行分析，鉴定筛选出合适的抗原物质，该技术即为基因组挖掘技术。利用该技术已经鉴定筛选出大量的疫苗候选蛋白：基因组衍生的奈瑟菌抗原GNA1870，NadA，及GNA2132等。GNA1870是一种几乎表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面的脂蛋白，分子量约29KD。有科学家采用免疫学方法将其命名为脂蛋白2086(Lipoprotein 2086,LP2086)，该蛋白能够结合人H因子而下调补体激活途径从而使细菌在人体血液内存活，因此该蛋白名称更改为fHBP，即H因子结合蛋白(factor H-binding prorein,fHBP)，从而反映其逃避宿主防御机制的这个重要功能。fHBP分为两个亚家族，A亚族和B亚族，基于聚类比对分析，fHBP蛋白系统发生树表明，B亚族约占分离株的70％，A亚族约占30％。fHBP的氨基酸序列较保守，同一亚 族内91.6％～100％氨基酸相同，不同亚族最低为62.8％。重组fHBP免疫产生的抗体可引起对同一类亚族的补体介导的杀菌作用，并能诱导对感染乳鼠模型的被动保护，但对不同类亚族的菌株不具有杀菌力。fHBP重组蛋白具有良好的免疫原性，能诱导机体产生高水平的杀菌抗体，且对顺序变异不敏感，其结构和保护性抗原表位可进行组合，因此完全具备作为候选疫苗免疫原性蛋白质的特征。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脑膜炎球菌联合疫苗，即ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，以减少接种针次，扩大免疫覆盖范围，提供更广泛的预防脑膜炎球菌的保护作用。本专利技术的另一目的在于提供ABC群脑膜炎球菌联合疫苗的制备方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，所述的联合疫苗包括：A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、以及B群脑膜炎球菌fHBP-A重组蛋白和fHBP-B重组蛋白，其中A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的含量，以多糖含量计分别为1-10μg/剂；重组蛋白fHBP-A和fHBP-B含量分别为20-40μg/剂，其中任选还包括生物制品用冻干保护剂或佐剂。优选的，其中A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的含量，以多糖含量计分别为4-6μg/剂；重组蛋白fHBP-A和fHBP-B含量分别为25-35μg/剂，疫苗的pH为6.4-7.4；铝含量为0.4-0.6mg/ml。本专利技术的A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖可通过以下方法制备获得：A群脑膜炎球菌采用CMCC 29201(A4)菌株，C群脑膜炎球菌采用CMCC 29205(C11)菌株，脑膜炎球菌经发酵培养后，采用沙培离心机、碟片式离心机或其他大容量离心机分离培养液，收集离心上清；将离心上清以100KD膜包超滤浓缩，采用25-80％的乙醇进行分级沉淀，收集沉淀并用无水乙醇及丙酮分别洗涤，得到粗制多糖；灭菌注射用水溶解多糖并经脱氧胆酸钠处理后，采用GE填料Capto adhere和Capto DEAE或其他厂家相同功能性质的离子交换填料，以串联层析或分步层析的方法进行粗糖精制，收集流穿峰，采用GE Sephadex G25Coarse对流穿峰进行脱盐，或30KD超滤浓缩去除盐类等小分子，乙醇沉淀或冻干回收多糖。荚膜多糖残余核酸和蛋白质含量均要求不高于10mg/g，本研究中不高于5mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于，所述疫苗含有：A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、以及B群脑膜炎球菌fHBP‑A重组蛋白和fHBP‑B重组蛋白，其中A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的含量，以多糖含量计分别为1‑10μg/剂；重组蛋白fHBP‑A和fHBP‑B含量分别为20‑40μg/剂，其中任选还包括生物制品用冻干保护剂或佐剂。

【技术特征摘要】
1.一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于，所述疫苗含有：A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、以及B群脑膜炎球菌fHBP-A重组蛋白和fHBP-B重组蛋白，其中A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的含量，以多糖含量计分别为1-10μg/剂；重组蛋白fHBP-A和fHBP-B含量分别为20-40μg/剂，其中任选还包括生物制品用冻干保护剂或佐剂。2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，其中A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的含量，以多糖含量计分别为4-6μg/剂；重组蛋白fHBP-A和fHBP-B含量分别为25-35μg/剂，疫苗的pH为6.4-7.4；铝含量为0.4-0.6mg/ml。3.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述的A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物，为荚膜多糖与破伤风类毒素，白喉类毒素，或白喉无毒变异株结合的多糖蛋白结合物。4.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，为供皮下或肌肉注射的冻干或液体制剂。5.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，所述疫苗为冻干剂型，采用乳糖、明胶、蔗糖或人血白蛋白等保护剂成份制备成冻干制剂，以西林瓶分装冻干；稀释剂为无菌、无热原的注射用水、生理盐水或PBS等，以预填充注射器或西林瓶分装。6.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，所述疫苗为液体剂型，采用氢氧化铝、磷酸铝或其他铝佐剂等制备成铝吸附液体疫苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏桂民，杜琳，朱卫华，冀颖，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11