一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重免疫荧光分析方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法。本发明专利技术操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病原。本发明专利技术方法，能够同时检测鉴别鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体，而且具有特异性强，灵敏度高，重复性好等优点，可实现同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测。本发明专利技术灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病原的种类。

A multiple immunofluorescence assay for detection of Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma urealyticum

The invention discloses a method for detecting the mycoplasma and Mycoplasma in chicken. The invention has the advantages of simple operation, through the PCR to obtain the target fragment, then the amplified products, fluorescent microspheres and hybrid encoding streptavidin avidin phycoerythrin, and then through the detector reads the MFI value, resolution of different types of pathogens. The method of the invention can simultaneous detection and identification of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae, but also has strong specificity, high sensitivity, good repeatability, can achieve a variety of different purposes in the same molecular samples were detected at the same time. The invention has the advantages of good flexibility, and can be used to add and subtract pathogenic species according to needs.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于养殖业的病原检测领域，具体涉及一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法。
技术介绍
鸡支原体病是由支原体引起的传染病，以直接接触经呼吸道感染和经蛋感染为主要传播途径，最常见的为鸡毒支原体（MG）和滑液囊支原体（MS）。鸡毒支原体主要引起鸡慢性呼吸道症状、气囊炎、产蛋下降，是支原体中对养禽业造成最严重经济损失者；鸡滑液囊支原体主要引起鸡的关节病变和亚临床呼吸道症状，气囊炎和关节病变导致肉仔鸡酮体的废弃率明显增加。临床上常出现两者同时混合感染的情况。鸡群被支原体感染后，其机体的免疫功能降低，导致对其他传染病因的易感性增加，致使死亡率增加，生产性能降低而造成严重的经济损失。近几年，随着集约化养鸡业的发展，鸡群中支原体感染已十分普遍，有的鸡群支原体感染率已高达56.9 %，严重阻碍了养鸡业的健康发展。目前对 MG 和MS的常规诊断方法主要采取血清学和分离培养2种方法。血清学方法由于常出现非特异性的交叉反应而影响诊断的准确性；而分离培养，由于其对所需条件要求苛刻，费时费力，已不适应现代集约化养禽业发展的需要。针对此情况分子生物学方法被广泛应用，最近国内外建立了PCR/多重PCR、荧光定量PCR等检测方法。虽然PCR技术具有特异性强、敏感度高的优点，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。荧光定量PCR技术融合了PCR的多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，而建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道，使实验难度加大。目前，还未见有应用多重免疫荧光分析方法对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行检测的报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中所存在的不足，本专利技术的一个目的在于提供一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析引物组；本专利技术的另一个目的在于提供一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析试剂盒；本专利技术的另一个目的在于提供一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种用于检测鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）和鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）的多重荧光免疫分析引物组，其包括：用于检测鸡毒支原体的引物对G1和G2、用于检测鸡滑液囊支原体的引物对S1和S2，其特征在于：所述用于检测鸡毒支原体的引物对是根据鸡毒支原体的PVPA基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡滑液囊支原体的引物对是根据鸡滑液囊支原体的vlhA基因的保守序列设计的。作为优选的，所述用于检测鸡毒支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：MG引物G1：5’-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3’（SEQ ID NO.1），MG引物G2：5’-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3’（SEQ ID NO.2）；用于检测鸡滑液囊支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：MS引物S1：5’-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3’（SEQ ID NO.3），MS引物S2：5’-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3’（SEQ ID NO.4）。优选的，引物G1和S1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。优选的，引物G1和S1的5’端的tag序列分别为：引物G1的tag序列为：5’-CACTACACATTTATCATAACAAAT-3’（SEQ ID NO.5）；引物S1的tag序列为：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3’（SEQ ID NO.6）。优选的，引物G2和S2的5’端还添加有生物素标记。一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：（1）以上所述的多重荧光免疫分析引物组；（2）2种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与多重荧光免疫分析引物组的上游引物上的tag序列互补配对；（3）链霉亲和素-藻红蛋白复合物。一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：1）从样品中提取DNA，以DNA为模板，加入以上任一项所述的引物组进行PCR扩增；2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定其支原体的类型；优选的，步骤2）中的荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列，所述anti-tag序列能相应地与权利要求3中的tag序列互补配对。优选的，步骤1）中PCR扩增的反应体系为：2×Multiplex PCR Master Mix 10ul上游引物混合液 1ul（0.2uM,final conc.)下游引物混合液 1ul（0.2uM,final conc.)模板 1ul（＜500ng）ddH2O 7ulTotal 20ul优选的，步骤1）中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。优选的，步骤2）中扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交的体系为：荧光编码微球 20µL链霉亲和素-藻红蛋白 75µL扩增产物 5µLTotal 100µL37℃反应30min。本专利技术的有益效果是 ：本专利技术的上游引物5’端的特异性的tag序列，可以与包被有特异的anti-tag序列的2种荧光编码微球结合，而下游引物5’端的Biotin标记，可以与链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）进行杂交。本专利技术方法同时对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行检测时，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值时，分辩不同类型的支原体。本专利技术的方法将多重荧光免疫分析（MFIA）和TAG技术结合起来，TAG技术使用Luminex专有的通用标签，通过标签序列与反标签序列的专一性互补配对，进行核酸实验优化，产品开发和分子诊断化验。TAG技术能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。本专利技术方法，能够同时对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本专利技术方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析引物组，其包括：用于检测鸡毒支原体的引物对G1和G2、用于检测鸡滑液囊支原体的引物对S1和S2，其特征在于：所述用于检测鸡毒支原体的引物对是根据鸡毒支原体的PVPA基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡滑液囊支原体的引物对是根据鸡滑液囊支原体的vlhA基因的保守序列设计的。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析引物组，其包括：用于检测鸡毒支原体的引物对G1和G2、用于检测鸡滑液囊支原体的引物对S1和S2，其特征在于：所述用于检测鸡毒支原体的引物对是根据鸡毒支原体的PVPA基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡滑液囊支原体的引物对是根据鸡滑液囊支原体的vlhA基因的保守序列设计的。2.根据权利要求1所述的多重荧光免疫分析引物组，其特征在于，用于检测鸡毒支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：MG引物G1：5’-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3’（SEQ ID NO.1），MG引物G2：5’-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3’（SEQ ID NO.2）；用于检测鸡滑液囊支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：MS引物S1：5’-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3’（SEQ ID NO.3），MS引物S2：5’-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3’（SEQ ID NO.4）。3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于：引物G1和S1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于：引物G1和S1的5’端的tag序列分别为：引物G1的tag序列为：5’-CACTACACATTTATCATAACAAAT-3’（SEQ ID NO.5）；引物S1的tag序列为：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3’（SEQ ID NO.6）。5.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于：引物G2和S2的5’端还添加有生物素标记。6.一种用于检测检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：（1）权利要求1-5任一项所述的引物组；（2）2种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭鹏举，朱余军，丛峰，黄韧，陈梅丽，
申请(专利权)人：广东省实验动物监测所，
类型：发明
国别省市：广东;44