用于定点基因组修饰的组合物和方法技术

本公开提供新型玉米、番茄和大豆U6、U3、U2、U5和7SL snRNA启动子，所述启动子用于植物中的CRISPR/Cas介导的靶向基因修饰。本公开还提供使用U6、U3、U2、U5和7SL启动子驱动sgRNA多核苷酸的表达的方法，其于植物中的靶向基因修饰的CRISPR/Cas系统中发挥作用。本公开还提供将平末端DNA片段插入基因组切割位点的基因组修饰方法。

Compositions and methods for site-specific genomic modification

The invention provides a new type of corn, tomato and soybean U6, U3, U2, U5 and 7SL snRNA promoter, the promoter for CRISPR/Cas mediated in plant mediated targeted gene modification. The present invention also provides methods of using U6, U3, U2, U5, and 7SL promoter to drive the expression of sgRNA polynucleotides, which play a role in the targeted gene modified CRISPR/Cas system in plants. The present invention also provides a genomic modification method for inserting a flat end DNA fragment into a genomic cleavage site.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本专利申请要求提交于2014年2月27日的美国临时专利申请号61/945,700的优先权。序列表的并入序列表包含于名称为“MONS350WO_ST25.txt”的文件中，其大小为238千字节(在MS-Windows中计算)，创建于2015年2月27日，该序列表据此以电子方式提交并且以引用方式并入本文。
本公开涉及生物
更具体地讲，本公开提供将重组平末端双链DNA片段引入植物的基因组的方法，该方法通过将双链断裂和新型植物启动子(该启动子有益于例如用于CRISPR介导的基因组修饰的非蛋白质编码小RNA的表达)引入基因组来进行。
技术介绍
位点特异性重组在许多广泛的生物技术相关领域中具有应用潜力。包含DNA结合域和DNA切割域的大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)能够进行基因组修饰。虽然大范围核酸酶、ZFN和TALEN具有有效性和特异性，但这些技术需要通过被选为进行修饰的每个基因组位点的一个或多个元件的蛋白质工程生成。成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)应用的最新进展示出了与类似系统(大范围核酸酶、ZFN和TALEN)同样强大的基因组修饰方法，但具有快速工程化的优势。成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统构成原核生物中靶向入侵噬菌体的核酸内切的后天免疫系统。该系统由蛋白质元件(Cas)以及使该蛋白值靶向特异性核酸内切基因座的向导RNA(gRNA)构成。该系统已成功工程化为靶向哺乳动物、斑马鱼、果蝇、线虫、细菌、酵母和植物基因组的特异性核酸内切基因座。专利技术简述在一个方面，本专利技术提供包含snRNA启动子(选自由以下组成的组：U6启动子、U3启动子、U2启动子、U5启动子和7SL启动子)的重组DNA构建体；该启动子可操作地连接至编码单向导RNA(sgRNA)的序列，其中所述snRNA启动子的序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：146-149、SEQ ID NO：160-201或SEQ ID NO：247-283；或其片段，其中该片段的长度为至少140bp。在一个实施方案中，所述U6启动子的序列可包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：146-149、SEQ ID NO：160-166、SEQ ID NO：200-201或SEQ ID NO：283中的任一者，或其片段，其中该片段的长度为至少140bp。在另一个实施方案中，所述U6启动子的序列可包含SEQ ID NO：7。在另一个实施方案中，所述U6启动子的序列可包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20。在又一个实施方案中，所述U3启动子的序列可包含SEQ ID NO：167-171或SEQ ID NO：178-182中的任一者，或其片段；其中该片段的长度为至少140bp。在又一个实施方案中，所述U2启动子的序列包含SEQ ID NO：183-187、SEQ ID NO：192-199或SEQ ID NO：247-275中的任一者，或其片段；其中该片段的长度为至少140bp。在另一个实施方案中，所述U5启动子的序列包含SEQ ID NO：188-191或SEQ ID NO：276-282中的任一者，或其片段；其中该片段的长度为至少140bp。在另一个实施方案中，所述7SL启动子的序列包含SEQ ID NO：172-177中的任一者，或其片段；其中该片段的长度为至少140bp。该重组DNA构建体还可包含转录终止序列。该重组DNA构建体还可包含编码启动子的序列，该启动子可操作地连接至编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的Cas核酸内切酶基因产物的序列。在重组DNA构建体的某些实施方案中，Cas核酸内切酶基因产物可另外可操作地连接至核定位序列(NLS)。另外，在所设想的重组DNA构建体的某些实施方案中，编码所述Cas核酸内切酶的序列可选自由以下组成的组：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：136。本专利技术的另一个方面提供包含snRNA启动子(选自由以下组成的组：U6启动子、U3启动子、U2启动子、U5启动子和7SL启动子)的重组DNA构建体；该启动子可操作地连接至表示非编码RNA的序列，其中所述snRNA启动子的序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：146-149、SEQ ID NO：160-201或SEQ ID NO：247-283，或其片段，其中该片段的长度为至少140bp。在一些实施方案中，非编码RNA选自由以下组成的组：微RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)以及编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹状双链RNA(发夹状dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)和天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)。本专利技术的某些实施方案还包括此类重组DNA构建体，其中所述U3启动子的序列包含SEQ ID NO：167-171和SEQ ID NO：178-182中的任一者，或其片段；其中该片段的长度为至少140bp。在重组DNA构建体的另一个实施方案中，所述U2启动子的序列包含SEQ ID NO：183-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含snRNA启动子的重组DNA构建体，所述snRNA启动子选自由以下组成的组：U6启动子、U3启动子、U2启动子、U5启动子和7SL启动子；所述启动子可操作地连接至编码单向导RNA(sgRNA)的序列，其中所述snRNA启动子的序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:146‑149、SEQ ID NO:160‑201或SEQ ID NO:247‑283；或其片段，其中所述片段的长度为至少140bp。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.27 US 61/945,7001.一种包含snRNA启动子的重组DNA构建体，所述snRNA启动子选自由以下组成的组：U6启动子、U3启动子、U2启动子、U5启动子和7SL启动子；所述启动子可操作地连接至编码单向导RNA(sgRNA)的序列，其中所述snRNA启动子的序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:146-149、SEQ ID NO:160-201或SEQ ID NO:247-283；或其片段，其中所述片段的长度为至少140bp。2.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述U6启动子的序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:146-149、SEQ ID NO:160-166、SEQ ID NO:200-201或SEQ ID NO:283中的任一者，或其片段，其中所述片段的长度为至少140bp。3.根据权利要求2所述的重组DNA构建体，其中所述U6启动子的序列包含SEQ ID NO:7。4.根据权利要求2所述的重组DNA构建体，其中所述U6启动子的序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。5.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述U3启动子的序列包含SEQ ID NO:167-171或SEQ ID NO:178-182中的任一者，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp。6.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述U2启动子的序列包含SEQ ID NO:183-187、SEQ ID NO:192-199或SEQ ID NO:247-275中的任一者，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp。7.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述U5启动子的序列包含SEQ ID NO:188-191或SEQ ID NO:276-282中的任一者，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp。8.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述7SL启动子的序列包含SEQ ID NO:172-177中的任一者，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp。9.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，还包含转录终止序列。10.根据权利要求1所述的重组DNA构建体，还包含编码启动子的序列，所述启动子可操作地连接至编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的Cas核酸内切酶基因产物的序列。11.根据权利要求10所述的重组DNA构建体，其中所述Cas核酸内切酶基因产物还可操作地连接至核定位序列(NLS)。12.根据权利要求10所述的重组DNA构建体，其中编码所述Cas核酸内切酶的序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:136。13.一种包含snRNA启动子的重组DNA构建体，所述启动子选自由以下组成的组：U6启动子、U3启动子、U2启动子、U5启动子和7SL启动子；所述启动子可操作地连接至表示非编码RNA的序列，其中所述snRNA启动子的序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:146-149、SEQ ID NO:160-201或SEQ ID NO:247-283，或其片段，其中所述片段的长度为至少140bp。14.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA选自由以下组成的组：微RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)以及编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹状双链RNA(发夹状dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)和天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)。15.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述U3启动子的序列包含SEQ ID NO:167-171和SEQ ID NO:178-182中的任一者，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp。16.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述U2启动子的序列包含SEQ ID NO:183-187、SEQ ID NO:192-199或SEQ ID NO:247-275中的任一者，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp。17.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述U5启动子的序列包含SEQ ID NO:188-191或SEQ ID NO:276-282中的任一者，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp。18.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述U6启动子的序列包含SEQ ID NO:1-20、SEQ ID NO:146-149、SEQ ID NO:160-166、SEQ ID NO:200-201或SEQ ID NO:283中的任一者，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp。19.根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其中所述7SL启动子的序列包含SEQ ID NO:172-177中的任一者，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp。20.一种细胞，其包含根据权利要求1所述的重组DNA构建体。21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。22.一种将双链断裂引入所述细胞的基因组的方法，所述方法包括将以下引入所述细胞：a)至少一种根据权利要求1所述的重组DNA构建体；和b)第二重组DNA构建体，所述第二重组DNA构建体包含编码启动子的序列，所述启动子可操作地连接至编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的Cas核酸内切酶基因产物的序列，所述Cas核酸内切酶基因产物可操作地连接至核定位序列(NLS)。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述U6启动子的序列包含SEQ ID NO:7。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述U6启动子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的。25.根据权利要求22所述的方法，其中编码所述Cas核酸内切酶的序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:136。26.一种将双链断裂引入所述细胞的基因组的方法，所述方法包括将至少一种根据权利要求10所述的重组DNA构建体引入所述细胞。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述U6启动子的序列包含SEQ ID NO:7。28.根据权利要求26所述的方法，其中所述U6启动子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的。29.根据权利要求26所述的方法，其中编码所述Cas核酸内切酶的序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:136。30.一种基因组修饰方法，所述方法包括：a)将双链断裂引入所述植物细胞的基因组中的选择位点，以及b)将重组平末端双链DNA片段引入所述植物细胞，其中所述重组平末端双链DNA片段通过内源性DNA修复并入所述双链断裂。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述基因组修饰包括修饰连锁障碍、连接两个或更多个QTL、破坏两个或更多个QTL的连锁、基因插入、基因置换、基因转换、基因缺失或断裂、转基因事件选择、转基因性状供体选择、转基因置换或至少一种所关注的核酸的靶向插入。32.根据权利要求30所述的方法，其中所述双链断裂通过核酸内切酶引入。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述核酸内切酶选自由以下组成的组：TALEN核酸内切酶；CRISPR核酸内切酶；包含\LAGLIDADG”、“GIY-YIG”、“His-Cys框”或HNH序列基序的大范围核酸酶；以及锌指核酸酶。34.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物细胞是原生质体或在植物细胞培养物中生长。35.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物细胞选自由以下组成的组：大豆植物细胞；玉米植物细胞；稻米植物细胞；小麦植物细胞；草坪植物细胞；棉花植物细胞；和芥花籽植物细胞。36.根据权利要求30所述的方法，其中所述重组平末端双链DNA片段不包含与所述基因组中的所述选择位点同源的区域。37.根据权利要求30所述的方法，其中将约0.03至约0.3fmol的重组平末端双链DNA片段引入所述植物细胞。38.根据权利要求37所述的方法，其中将约0.15fmol的重组平末端双链DNA片段引入所述植物细胞。39.根据权利要求30所述的方法，其中所述平末端双链DNA片段包含在5’末端或3’末端或5’和3’末端二者上，与包含所述基因组中的所述双链断裂的一个或两个末端的序列微同源的区域。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述微同源区域选自：长度为1bp、2bp、3bp、4,bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或10bp的序列。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述微同源区域的长度为3bp。42.根据权利要求30所述的方法，其中在步骤a)中通过为所述细胞提供核酸内切酶来引入双链断裂，所述核酸内切酶设计为靶向所述细胞的所述基因组中的选择靶标位点。43.根据权利要求42所述的方法，其中所述核酸内切酶由至少一种编码所述核酸内切酶的重组DNA构建体提供。44.根据权利要求42所述的方法，其中所述核酸内切酶通过将编码所述核酸内切酶的mRNA或所述核酸内切酶递送至所述植物细胞来提供。45.根据权利要求42所述的方法，其中所述核酸内切酶选自由以下组成的组：TALEN核酸内切酶；锌指核酸内切酶；大范围核酸酶；和CRISPR核酸内切酶。46.根据权利要求30所述的方法，其中在步骤a)中通过为所述细胞提供编码启动子的重组DNA构建体，所述启动子可操作地连接至编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的Cas核酸内切酶基因产物的序列；和包含U6、U3、U2、U5或7SL启动子的重组DNA构建体，所述U6、U3、U2、U5或7SL启动子可操作地连接至编码单向导RNA(sgRNA)的序列，所述单向导RNA设计为靶向所述细胞的所述染色体中的选择靶标位点，来引入双链断裂。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述Cas核酸内切酶基因产物还可操作地连接至至少一个核定位序列(NLS)。48.根据权利要求46所述的方法，其中所述U6、U3、U2、U5或7SL启动子的序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:146-149、SEQ ID NO:160-201或SEQ ID NO:247-283，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp并且包含转录终止序列。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述U6启动子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1-20、SEQ ID NO:146-149、SEQ ID NO:160-166、SEQ ID NO:200-201和SEQ ID NO:283，或其片段；其中所述片段的长度为至少140bp，包含转录终止序列。50.根据权利要求48所述的方法，其中所述U6启动子的序列包含SEQ ID NO:7。51.根据权利要求48所述的方法，其中所述U6启动子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·布罗沃托兰德，A·Y·库拉诺夫，R·库恩，R·J·劳伦斯，E·D·纳吉，L·赖默奎斯，V·维纳，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US