一种提取远志糖蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取远志糖蛋白的方法。本发明专利技术所提供的提取远志糖蛋白的方法，包括如下步骤：(a)将远志粉碎并脱脂；(b)将经脱脂后的远志粉末在pH为7.5‑8.2的缓冲液中浸提；浸提温度为25‑40℃；浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：7.5‑9mL；(c)将所得浸提液过滤，除去滤液中的游离蛋白，得到远志糖蛋白粗提取液。本发明专利技术所提供的远志糖蛋白提取工艺是一套提取效率高、条件简便的工艺，远志糖蛋白提取率均值可高达5.96％。本发明专利技术对后期远志糖蛋白的分离纯化及活性研究具有一定的参考价值和实际意义。本发明专利技术不仅可以提高远志药材的使用价值，而且可以拓展免疫类新型药物或新型保健品的开发渠道。

Method for extracting glycoprotein from Polygala tenuifolia

The invention discloses a method for extracting the glycoprotein of Polygala tenuifolia. The extraction methods of glycoprotein Polygala provided by the invention, which comprises the following steps: (a) the Polygala crushing and degreasing; (b) the Polygala powder was defatted in pH 7.5 buffer 8.2 leaching; extraction temperature is 25 40 DEG C; leaching the mention of Polygala powder and the buffer ratio is 1g:7.5 9mL; (C) the extract filter, remove free protein in the filtrate, get the glycoprotein extract of Radix polygalae. The invention provides a process for extracting the glycoprotein from the Polygala tenuifolia Willd, which has a high extraction efficiency and a simple condition, and the average extraction rate of the glycoprotein can be as high as 5.96%. The present invention has certain reference value and practical significance for the separation and purification of the crude extract of Polygala tenuifolia willd. The invention not only can improve the use value of the Polygala tenuifolia herb, but also can expand the development channels of the new medicine or the new health care product.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于中药糖蛋白提取领域，涉及一种提取远志糖蛋白的方法。
技术介绍
糖蛋白(glycoprotein)是一类由寡糖与多肽链或蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白，广泛存在于植物中，并以不同的形式存在，对于生物体的各项生命活动起着十分重要的作用，是生物体内必不可少的生物大分子之一。研究报道指出，糖蛋白具有抗癌、抗氧化、抗疲劳、抑制肿瘤等多方面的生物活性及生理功能。基于糖蛋白的生物学功能渐渐被挖掘，以多糖结构、功能为核心的糖工程被认为是继蛋白质工程、基因工程后生物化学和分子生物学领域中又一巨大的科学问题，吸引着众多学科领域的探讨研究。由于糖蛋白是以蛋白质为主，只是在某些部位连接有一些短的糖链基团，一般可采用提取纯化蛋白质的方法来提取糖蛋白。大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，并且糖蛋白中的糖链具有高度亲水性，所以大多数糖蛋白均以水溶液提取为主，常用的方法有水提取法、稀盐溶液或缓冲溶液提取法、酸碱溶液提取法、醇提取法、酶解液提取法等，具体方法可根据不同实验需求类别选择。但由于糖蛋白活性的保持需要一个相对稳定、平衡的生存环境，所以在提取糖蛋白的过程中，要严格控制提取条件，以免破坏糖蛋白的结构及生物活性[刘兴华,赵浩如.天然糖蛋白的提取、分离与纯化[M].药学进展,2006,30(12):542-547.]。可以说，糖蛋白的分离纯化是一个相对较长并需要重复摸索的过程，通常需要进行大量的预实验来确定不同来源糖蛋白各自特异的分离纯化条件。远志(Polygala tenuifolia Willd.)作为历代药食同源的药材之一，被称为“养命之要药”，具有安神益智、祛痰、消肿的功能，可用于心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸，神志恍惚，咳痰不爽，疮疡肿毒，乳房肿痛等。目前国内外对动物类、海洋类糖蛋白的研究较多，但针对中药糖蛋白的研究尚不全面。目前还没有提取、分析研究远志药材中的糖蛋白类成分的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提取远志糖蛋白的方法。本专利技术所提供的提取远志糖蛋白的方法，具体可包括如下步骤：(a)将远志粉碎并脱脂；(b)将经步骤(a)脱脂后的远志粉末在pH为7.5-8.2的缓冲液中浸提；进行所述浸提时的温度为25-40℃；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：7.5-9mL；(c)将步骤(b)所得浸提液过滤，除去滤液中的游离蛋白，得到远志糖蛋白粗提取液。在步骤(b)中，所述缓冲液的pH进一步可为7.5-8.0；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比进一步可为1g：7.5-8.5mL。更加具体的，所述缓冲液的pH最好为7.85；进行所述浸提时的温度最好为33℃；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比最好为1g：8.0mL。在步骤(b)中，所述缓冲液具体可为Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液中最好含有浓度为0.05-0.1mol/L的NaCl；进行所述浸提的时间具体可为1-2h。更加具体的，所述缓冲液中NaCl的浓度最好为0.1mol/L；进行所述浸提的时间最好为1.5h。在步骤(a)中，所述“将远志粉碎并脱脂”具体可通过包括如下步骤的方法实现：将远志粉碎后的粉末用5倍量的石油醚30-60(即30-60℃沸程规格的石油醚)，40-45℃水浴脱脂1h，过滤，向滤渣中继续加入3倍量的所述石油醚30-60，40-45℃水浴脱脂0.5h，过滤，滤渣自然晾干，即得脱脂后的远志粉末。其中，“n倍量”的单位为mL/g，表示1g远志粉末应加入的所述石油醚30-60毫升数为n。如5倍量表示1g远志粉末应加入5ml所述石油醚30-60。其中，在将远志粉碎后，加入5倍量的石油醚30-60前可还包括用对远志粉末进行过筛的步骤。具体可为过50目筛(3号筛，50目，孔径大小为355±13μm)。在步骤(c)中，所述除去滤液中的游离蛋白的方法具体可为经Sevage法脱除游离蛋白。其中，所述经Sevage法脱除游离蛋白的具体方法可参见“赵梅,丁霄霖.甘薯糖蛋白脱游离蛋白的研究[J].食品与生物技术学报,2006,01:89-91.”一文。另外，本专利技术所提供的提取远志糖蛋白的方法在步骤(c)之后，还可包括如下“步骤(d)”或“步骤(d)和(e)”或“步骤(d)、(e)和(f)”：(d)将所述远志糖蛋白粗提取液在无NaCl的pH7.85的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中透析24h，离心(如常温3500r/min离心10分钟)，取上清液。该步骤的目的是除去其中的一些无机盐、色素、低聚糖等小分子杂质。(e)将步骤(d)所得的上清液用DEAE-52阴离子交换层析，收集用0.1mol/LTris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.3mol/L NaCl洗脱所得的洗脱液。(f)将步骤(e)所得洗脱液进行冷冻干燥，即得远志糖蛋白。在步骤(e)中，将预处理过的DEAE-52用缓冲液A(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85不含NaCl)平衡；再以2个柱体积缓冲液A洗脱未被吸附的糖蛋白液，并收集；然后分别依次以2倍柱体积的缓冲液B(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.06mol/L NaCl)、缓冲液C(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.1mol/L NaCl)、缓冲液D(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.3mol/L NaCl)、缓冲液E(0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH＝7.85含0.5mol/L NaCl)进行阶段洗脱，收集各阶段的洗脱液。在步骤(f)中，所述冷冻干燥具体可为：-86℃冷冻24h以上。本专利技术所提供的提取远志糖蛋白的方法即为制备含有远志糖蛋白的提取物的方法或者为制备远志糖蛋白的方法。利用本专利技术所提供的提取远志糖蛋白的方法所得的含有远志糖蛋白的提取物或者远志糖蛋白，以及所述提取物或者远志糖蛋白在如下任一中的应用也属于本专利技术的保护范围。(1)制备具有抗衰老活性的产品；其中，所述抗衰老活性可体现为如下中的至少一种：减缓D-半乳糖导致的脏器萎缩；提高血清中SOD和/或CAT的活力；提高脑组织中SOD的活力；降低脑组织中MDA的含量。(2)制备具有免疫促进活性的产品。其中，所述免疫促进活性可体现为如下中的至少一种：减缓免疫器官的萎缩；提高血清中IL-2和/或IL-6的含量。在本专利技术中，所述远志具体为中药材远志。本专利技术采用响应曲面法对远志糖蛋白的提取工艺进行优化，确定了一套提取效率高、条件简便的提取工艺，在此提取条件下，远志总糖蛋白提取率均值可高达5.96％。同时，本专利技术确定了远志糖蛋白的分离方法，因此，本试验从蛋白稳定性、提取得率与分离三个方面进行了综合考量。本专利技术不仅可以提高远志药材的使用价值，而且可以拓展免疫类新型药物或新型保健品的开发渠道。附图说明图1为蛋白质的标准曲线。图2为缓冲液pH值对远志糖蛋白提取率的影响。图3为温度对远志糖蛋白提取率的影响。图4为盐浓度对远志糖蛋白提取率的影响。图5为液料比对远志糖蛋白提取率的影响。图6为提取时间对远志糖蛋白提取率的影响。图7为pH值、温度的等高线图和响应曲面图。图8为pH、液料比的等高线图和响应曲面图。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取远志糖蛋白的方法，包括如下步骤：(a)将远志粉碎并脱脂；(b)将经步骤(a)脱脂后的远志粉末在pH为7.5‑8.2的缓冲液中浸提；进行所述浸提时的温度为25‑40℃；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：7.5‑9mL；(c)将步骤(b)所得浸提液过滤，除去滤液中的游离蛋白，得到远志糖蛋白粗提取液。

【技术特征摘要】
1.一种提取远志糖蛋白的方法，包括如下步骤：(a)将远志粉碎并脱脂；(b)将经步骤(a)脱脂后的远志粉末在pH为7.5-8.2的缓冲液中浸提；进行所述浸提时的温度为25-40℃；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：7.5-9mL；(c)将步骤(b)所得浸提液过滤，除去滤液中的游离蛋白，得到远志糖蛋白粗提取液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述缓冲液的pH为7.5-8.0；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：7.5-8.5mL。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述缓冲液的pH为7.85；进行所述浸提时的温度为33℃；进行所述浸提时所述远志粉末与所述缓冲液的配比为1g：8.0mL。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液中含有浓度为0.05-0.1mol/L的NaCl；和/或进行所述浸提的时间为1-2小时。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述缓冲液中NaCl的浓度为0.1mol/L；进行所述浸提的时间为1.5小时。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述“将远志粉碎并脱脂”是通过如下实现的：将远志粉碎后的粉末...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颖莉，张娟娟，贺文彬，刘仕琦，许凯霞，
申请(专利权)人：山西中医学院，
类型：发明
国别省市：山西;14