干细胞生物活性组合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种干细胞生物活性组合物及其制备方法与应用，所述干细胞生物活性组合物含有1.69‑22.24pg/mL EGF、2443.17‑4459.43pg/mL bFGF、1.44‑134.36pg/mL beta‑NGF、1.55‑355.14pg/mL VEGF、11.87‑159.70pg/mL PDGF‑DD、135.79‑688.13pg/mL KGF、1176.99‑3825.79pg/mL TGF‑β1，所述干细胞生物活性组合物具有高纯度、高产量、高生物活性。

Stem cell biological active composition, preparation method and application thereof

The invention discloses a stem cell biological composition and preparation method and application thereof, wherein the stem cell biological activity compositions containing 1.69 22.24pg/mL EGF, 2443.17 bFGF, 1.44 4459.43pg/mL 134.36pg/mL beta NGF, 1.55 VEGF, 11.87 355.14pg/mL 159.70pg/mL PDGF DD, 135.79 688.13pg/mL KGF, 1176.99 3825.79pg/mL TGF beta 1, the stem cell biological activity compositions with high purity and high yield, high biological activity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其是涉及生物活性物质，更具体地，本专利技术涉及干细胞生物活性组合物及其制备方法与应用。
技术介绍
干细胞(Stem Cell)是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞，它是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的“万能细胞”。根据其发育阶段可分为胚胎干细胞与成体干细胞。其中成体干细胞(Adult stem cell，ASC)分布广、增殖能力强、具有多向分化潜能且无伦理或宗教问题，可来源于骨髓、脂肪、皮肤、肌肉、角膜等各类组织，包括间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)、造血干细胞、表皮干细胞、内皮干细胞、胃肠干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌肉干细胞、神经元干细胞、脐带血干细胞等。近年来，随着对干细胞研究的逐渐深入，发现其在增殖分化过程中产生或分泌了大量的生物活性物质，这是一种包含了生长因子、蛋白质、活性多肽、微量元素等多种促进细胞生长、活化与再生的物质，如表皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、转化生长因子β(TGF-β)、白介素－6(IL-6)、白介素－7(IL-7)、天然免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD等。然而，目前制备干细胞生物活性物质的技术以及制备获得的干细胞生物活性物质的产量和质量仍有待改进。
技术实现思路
目前实际中应用的干细胞生物活性物质大多存在以下不足：1.直接从胎盘等组织中提取，致使所得到的干细胞生物活性物质纯度低；2.采用含有动物源成分(如胎牛血清)的培养液进行干细胞的扩增培养，提取的物质中不可避免的含有动物来源的成分甚至含有存在于动物体内的病毒等，安全性低；3.干细胞内含有丰富的生物活性物质，对干细胞的增殖分化等非常重要，但这些物质并不分泌到细胞外，故常在提取过程中被遗漏；4.多采用单一的胚胎干细胞或成体干细胞进行培养而收集上清，未考虑到体内细胞复杂的生长环境与不同种类细胞之间的相互作用，导致提取的生物活性物质的产量不高。本专利技术旨在至少
在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提出一种具有高纯度、高产量、高生物活性的干细胞生物活性组合物，所述干细胞生物活性组合物含有1.69-22.24pg/mL EGF、2443.17-4459.43pg/mL bFGF、1.44-134.36pg/mL beta-NGF、1.55-355.14pg/mL VEGF、11.87-159.70pg/mL PDGF-DD、135.79-688.13pg/mL KGF、1176.99-3825.79pg/mL TGF-β1，上述干细胞生物活性组合物具有较高的生物活性，并且所述干细胞生物活性组合物中各个生物活性因子具有较高含量。根据本专利技术的一个实施例，所述干细胞生物活性组合物含有18.47pg/mL EGF、4447.00pg/mL bFGF、32.66pg/mL beta-NGF、27.77pg/mL VEGF、77.04pg/mL PDGF-DD、688.13pg/mL KGF、3312.99pg/mL TGF-β1。所述干细胞生物活性组合物具有较高的生物活性，并且所述干细胞生物活性组合物中各个生物活性因子具有较高含量。根据本专利技术的一个实施例，所述干细胞生物活性组合物是通过将间充质干细胞和脂肪基质细胞进行非接触式共培养获得的。相关研究表明，干细胞体外培养时在不同程度上需要依赖另外一些细胞对它们的滋养、支持作用。基质细胞是一类能够对干细胞起滋养作用的滋养细胞，多种基质细胞系已经被用来支持干细胞的体外培养。它们的存在可以更好地模拟体内环境，而且它们可以分泌多种已知的、未知的生长因子来支持干细胞的生长。脂肪组织提供了多能基质细胞的来源。研究发现，脂肪组织位于可以较易获得的结缔组织中，其中存在着抽脂术细胞，其克隆细胞株被称为脂肪基质细胞(Adipose tissue-derived stromal cell，ADSC)，这些细胞体内分布广、取材创伤小、细胞获得量大(每克脂肪组织存在高达8.6×104个基质细胞)，可补充、增殖稳定、具有美容效果等，是合适的基质细胞。当然，具有与脂肪基质细胞相似特点的细胞还可来自于其它组织，这些组织包括但不限于骨、骨髓、软骨、结缔组织、韧带组织或腱、骨骼肌、平滑肌、皮肤、外周血、脐带血、胎盘。虽然这些基质细胞并不相同，但它们所拥有的共性使它们可在体外行使相似的功能，尤其是可作为饲养层支持胚胎干细胞或成体干细胞的增殖并维持在未分化状态。进一步地，非接触式共培养在同一体系中实现两种细胞共培养，避免了直接接触式共培养中所存在的干细胞分离纯化困难、免疫安全性差、容易引起病毒传播等问题，解决了不同细胞的分离问题，便于培养结束后获得高纯度的干细胞；此外当培养模型中细胞间相互作用需要通过建立细胞间紧密连接和/或需要采用旁分泌的作用方式时，非接触式共培养不会引起干细胞的变化。根据本专利技术的再一个方面，本专利技术提出一种制备所述干细胞活性组合物的方法，包括以下步骤：(1)利用培养基，对间充质干细胞和脂肪基质细胞进行非接触式共培养；(2)收集含有间充质干细胞的培养液；以及(3)将所述含有间充质干细胞的培养液中的间充质
干细胞进行裂解后进行离心，并收集上清液，所述上清液构成所述干细胞活性组合物。利用该方法制备获得具有高纯度、高产量、高生物活性的干细胞生物活性组合物。需要说明的是，所述含有间充质干细胞的培养液中包含有间充质干细胞和培养基。根据本专利技术的一个实施例，所述非接触式共培养采用非接触培养装置，所述非接触培养装置包括：培养皿，所述培养皿中限定出下室，所述脂肪基质细胞接种于所述下室；Transwell，所述Transwell中限定出上室，所述Transwell具有PET膜，所述PET膜使所述上室和所述下室呈流体连通，所述间充质干细胞接种于所述上室。本专利技术所述方法采用Transwell培养板建立非接触式的干细胞和基质细胞体外共培养体系，培养结束后便于干细胞与基质细胞的分离，以便获得高纯度的干细胞生物活性物质。根据本专利技术的一个实施例，所述方法步骤(3)中进一步包括：(3-1)将所述含有间充质干细胞的培养液放入-20℃冷冻后，放入5℃中进行解冻，以便获得冻融后的含有间充质干细胞的培养液；(3-2)在振幅50％的情况下，对所述冻融后的含有间充质干细胞的培养液进行超声0-90min，收集并混合超声后的液体，以便获得超声后的含有间充质干细胞的培养液；(3-3)将所述超声后的含有间充质干细胞的培养液在10000rpm下离心30min后，于0.22μm微孔滤膜进行过滤，并收集上清液，所述上清液构成所述干细胞活性组合物。本专利技术所述方法采用超声破碎、低温冻融与高速离心等方法提取、分离、纯化细胞培养上清及干细胞内产生的生物活性物质，从而获得高纯度、高产量和高活性的干细胞生物活性物质。根据本专利技术的一个实施例，所述方法步骤(3-2)在振幅50％的情况下，对所述冻融后的含有间充质干细胞的培养液进行超声50min，收集并混合超声后的液体，以便获得超本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞生物活性组合物，其特征在于，含有：1.69‑22.24pg/mL EGF、2443.17‑4459.43pg/mL bFGF、1.44‑134.36pg/mL beta‑NGF、1.55‑355.14pg/mL VEGF、11.87‑159.70pg/mL PDGF‑DD、135.79‑688.13pg/mL KGF、1176.99‑3825.79pg/mL TGF‑β1。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞生物活性组合物，其特征在于，含有：1.69-22.24pg/mL EGF、2443.17-4459.43pg/mL bFGF、1.44-134.36pg/mL beta-NGF、1.55-355.14pg/mL VEGF、11.87-159.70pg/mL PDGF-DD、135.79-688.13pg/mL KGF、1176.99-3825.79pg/mL TGF-β1。2.根据权利要求1中所述干细胞生物活性组合物，其特征在于，所述干细胞生物活性组合物含有18.47pg/mL EGF、4447.00pg/mL bFGF、32.66pg/mL beta-NGF、27.77pg/mL VEGF、77.04pg/mL PDGF-DD、688.13pg/mL KGF、3312.99pg/mL TGF-β1。3.根据权利要求1或2中所述干细胞生物活性组合物，其特征在于，所述干细胞生物活性组合物是通过将间充质干细胞和脂肪基质细胞在培养基中进行非接触式共培养获得的。4.一种制备权利要求1-3任一项中所述干细胞活性组合物的方法，其特征在于，包括：(1)利用培养基，对间充质干细胞和脂肪基质细胞进行非接触式共培养；(2)收集含有间充质干细胞的培养液；以及(3)将所述含有间充质干细胞的培养液中的间充质干细胞进行裂解后进行离心，并收集上清液，所述上清液构成所述干细胞活性组合物。5.根据权利要求4中所述方法，其特征在于，所述非接触式共培养采用非接触培养装置，所述非接触培养装置包括：培养皿，所述培养皿中限定出下室，所述脂肪基质细胞接种于所述下室；Transwell，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，南雪，单紫筠，贾茜媛，吕洋，李静，姚海雷，岳文，
申请(专利权)人：华南生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44