一种混合氨基酸含量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种混合氨基酸含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理；(2)高效液相色谱检测，条件如下：色谱柱C18高效液相反相色谱柱；流动相A：0.01％～0.1％(v/v)的甲酸水溶液；流动相B：乙腈∶水＝70∶30～50∶50；洗脱梯度0～12min采用90％A和10％B；12～20min采用70％A和30％B；20～30min采用52％A和48％B；30min后采用100％B；柱温30～50℃；检测UV 254nm，按照以上条件将混合氨基酸色谱分离后，再将混合样品进行质谱检测确认。该方法，具有分离率高、重现性好、检测灵敏度高、选择性好、定量准确，操作简单，适用范围较广，适用于多种游离态氨基酸的检测等优点。

Method for measuring mixed amino acid content

The invention discloses a method for the determination of mixed amino acids, characterized by comprising the following steps: (1) the sample and standard of pre column derivatization treatment; (2) the following detection, HPLC conditions: C18 column high performance liquid chromatography on column; mobile phase (0.1% ~ A:0.01% v/v) formic acid aqueous solution; the mobile phase B: acetonitrile: water = 70: 30 to 50: 50; gradient elution 0 ~ 12min by 90%A and 10%B; 12 to 20min by 70%A and 30%B; 20 to 30min by 52%A and 48%B; 30min 100%B; column temperature 30 to 50 DEG C; the detection of UV 254nm, in accordance with the above conditions will be mixed amino acids after chromatography, then mixed samples were mass spectrometry confirmed. The method has the advantages of high separation rate, good reproducibility, high sensitivity, good selectivity, quantitative accuracy, simple operation, wide application range, etc., and is suitable for the detection of various free amino acids.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分析化学领域，更具体地，涉及一种混合氨基酸含量测定方法。
技术介绍
氨基酸分析检测应用十分广泛，主要应用于食品、医药科学、生态环境等领域。具体而言，富含人体必需氨基酸的食物被认为有高营养价值的，病理学上，血浆氨基酸和有机酸含量的变化作为先天性代谢疾病诊断和治疗的主要依据，生态环境领域，定量土壤环境中氨基酸含量的变化及追踪其转变过程作为描述N循环的强有力的证据。检测确定氨基酸含量的方法很多。高效液相色谱–电喷雾离子化-质谱(HPLC–ESI-MS)方法作为一种新兴的技术以其高选择性和低检出限显示出较强的优越性。该技术在同位素风度的测定方面已经展示了显著的应用潜能。理论上，对目标化合物的进行质谱检测的时候色谱分离不是必须的，以下三种情况除外：(1)旋光化合物如不先进行分离不能进行质谱分析；(2)同位素的出现可能干扰其他分子,尤其捕获离子的质荷比相差1或2时；(3)如果几种分子同时析出或者离子化时，可能会出现“化学抑制”现象。因此，质谱分析的时候良好的色谱分离是必须的，反之，分析确定未被衍生化的氨基酸时，高灵敏性的质谱分析同样必不可少。高效液相色谱–电喷雾离子化-质谱技术已经成功的应用于分析2，4-二硝基氟苯(DNFB)，9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)等衍生化试剂处理的氨基酸。但是，目前未见有关定量确认高效液相色谱–电喷雾离子化-质谱技术在异硫氰酸苯酯(PITC)衍生化处理的氨基酸方面的报道。目前异硫氰酸苯
酯衍生化处理的氨基酸的检测技术依然停留在通过和标准品保留时间的比对来确认的技术层面。另外，氨基酸的分离方面也存在一些问题。例如，CN 1749748A号专利公开了一种氨基酸的分析方法，在C18柱上，以pH2-3或6-7的磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)为流动相高效液相色谱分离氨基酸(AA)的2，4-二硝基氟苯(DNFB)衍生物，该专利使用磷酸三乙胺(TEAP)/乙腈(ACN)流动相用于氨基酸的分离。但是使用2，4-二硝基氟苯的氨基酸衍生条件复杂，且产物不稳定，分离结果的重现性不理想。CN 102621250A号专利公开了一种检测常见氨基酸的液相色谱方法以及其在中药板蓝根中的应用。该专利是将待测样品经过样品预处理后，加入反应溶剂及衍生化试剂9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)进行衍生化反应，然后采用高效液相色谱法测定20种常见氨基酸的浓度。该专利的方法采用通用型的液相色谱柱和紫外检测器对氨基酸进行高效液相色谱测定，使用乙腈和乙酸钠缓冲液作为流动相，可以排除其他物质对氨基酸的干扰。但是，该专利中作为流动相的乙酸钠本身具有不挥发性，容易出现盐析现象，析出的固态盐容易造成色谱柱、管路和密封垫圈的阻塞，影响整个HPLC系统的性能。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种混合氨基酸含量测定方法，其目的在于通过本专利技术报道的新型高效液相色谱–电喷雾离子化-质谱技术解决目前氨基酸检测方面的灵敏度不高、选择性不高、重复性不高、检测种类少等技术难题。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种混合氨基酸含量测定方法，包括以下步骤：(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理；(2)采用步骤(1)所述的标准品和高效液相色谱，对待测样品进行
检测，高效液相色谱条件如下：色谱柱：C18高效液相反相色谱柱；流动相：A：0.01％～0.1％(v/v)的甲酸水溶液；B：乙腈∶水＝70∶30～50∶50；洗脱梯度：0～12min采用90％A和10％B；12～20min采用70％A和30％B；20～30min采用52％A和48％B；30min后采用100％B；柱温：30～50℃检测波长：UV 254nm。(3)将经步骤(2)高效液相色谱分离的样品，进行质谱检测。优选地，所述氨基酸含量测定方法，其步骤(1)采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理。优选地，所述氨基酸含量测定方法，其步骤(1)所述标准品为氨基酸标准混合溶液，所述氨基酸标准混合溶液中每种氨基酸的浓度为2.5mmol/L。优选地，所述氨基酸含量测定方法，其所述氨基酸标准混合溶液，包括以下氨基酸种类：组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸。优选地，所述氨基酸含量测定方法，其步骤(3)所述质谱检测，条件如下：干燥温度，300℃；干燥气体N2，10L min-1；进样口压力，1.0kV；进样口电压，50V；去溶剂化温度，120℃；去溶剂化气体N2，2.5L min-1；进样口气体流速N2，1.7L min-1；离子源，ESI；全扫描模式；质量扫描范围50–600kDa。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于，能够取得下列有益效果：(1)本专利技术提供氨基酸含量测定方法，通过对样品进行前衍生化处理，并摸索了一套包括色谱柱、流动相、洗脱梯度、柱温、检测条件的测定参数，从而取得分离效率高、检测灵敏度高、定量准确的测定效果。(2)本专利技术优选方案，采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理，进一步提高分离效率、检测灵敏度和准确性的同时，重现性和选择性号，扩大了适用的氨基酸范围。(3)进一步地，采用高效液相色谱与质谱检测连用，使得定量准确，操作简单。附图说明图1是实施例1标准混合溶液中所含15种氨基酸的液相色谱图；图2是实施例1中15种PITC-氨基酸的LC-MS总粒子流图；图3是实施例1二级质谱分析结果图，其中图3(a)为组氨酸分析结果图；图3(b)为精氨酸分析结果图；图3(c)为丝氨酸分析结果图；图3(d)为甘氨酸分析结果图；图3(e)为谷氨酸分析结果图；图3(f)为天冬氨酸分析结果图；图3(g)为苏氨酸分析结果图；图3(h)为脯氨酸分析结果图；图3(i)为丙氨酸分析结果图；图3(j)为酪氨酸分析结果图；图3(k)为赖氨酸分析结果图；图3(l)为甲硫氨酸分析结果图；图3(m)为缬氨酸分析结果图；图3(n)为亮氨酸分析结果图；图3(o)为苯丙氨酸分析结果图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本专利技术提供的氨基酸含量测定方法，包括以下步骤：(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理。优选采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理，步骤如下：S1、取10μl待检测的溶液至1.5ml离心管中，65℃真空干燥2h，得到干燥的样品；S2、将上述S1干燥的样品溶于20μl的甲醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1的溶剂中，65℃真空干燥30min，得到预处理的样品；S3、取20μl的甲醇∶水∶三乙胺∶异硫氰酸苯酯＝7∶1∶1∶1的衍生试剂，加入到上述S2处理后的样品中，涡旋震荡，密封，在室温下放静置20min，65℃真空干燥30min，得到的样品待高效液相分析，-20℃保存待用。优选地，为了便于下一步LC-MS分析，将S3低温保存的样品按S4和S5处理：S4、将S3冷却保存的样品取出，加入12μl的60％乙腈溶液，涡旋振本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种混合氨基酸含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理；(2)采用步骤(1)所述的标准品和高效液相色谱，对待测样品进行检测，高效液相色谱条件如下：色谱柱：C18高效液相反相色谱柱流动相：A：0.01％～0.1％(v/v)的甲酸水溶液；B：乙腈∶水＝70∶30～50∶50洗脱梯度：0～12min采用90％A和10％B；12～20min采用70％A和30％B；20～30min采用52％A和48％B；30min后采用100％B；柱温：30～50℃；检测波长：UV 254nm；(3)将经步骤(2)高效液相色谱分离的样品，进行质谱检测。

【技术特征摘要】
1.一种混合氨基酸含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对待测样品及标准品进行柱前衍生化处理；(2)采用步骤(1)所述的标准品和高效液相色谱，对待测样品进行检测，高效液相色谱条件如下：色谱柱：C18高效液相反相色谱柱流动相：A：0.01％～0.1％(v/v)的甲酸水溶液；B：乙腈∶水＝70∶30～50∶50洗脱梯度：0～12min采用90％A和10％B；12～20min采用70％A和30％B；20～30min采用52％A和48％B；30min后采用100％B；柱温：30～50℃；检测波长：UV 254nm；(3)将经步骤(2)高效液相色谱分离的样品，进行质谱检测。2.如权利要求1所述的混合氨基酸含量测定方法，其特征在于，所述步骤(1)采用异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化处理。3.如权利要求1所述的混合氨基酸含量...

【专利技术属性】
技术研发人员：余龙江，郑桂花，周蓬蓬，金文闻，白云，朱圆敏，汪璨，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42