猫儿屎的离体培养方法技术

本发明专利技术公开了一种以未成熟果实的种胚作为外植体，依次经过愈伤组织的诱导、不定芽分化诱导、不定芽增殖培养和生根诱导培养获得猫儿屎再生植株。在进行愈伤组织的诱导之前，还包括：外植体的灭菌：取猫儿屎幼嫩果实，首先在每100ml含6‑10滴的洗洁净液中浸泡20‑30min后刷洗表面，之后用水冲洗1‑2h，然后在无菌环境中先用75％的酒精灭菌处理幼嫩果实30‑60s，之后用每100ml含3‑4滴土温40的0.1％HgCl2溶液对其灭菌15min，再用无菌水清洗4‑6次，每次1‑3min，最后取出幼嫩种子，挤出幼嫩种胚，使用无菌水漂洗幼嫩种胚后获得外植体。本发明专利技术方法可高频率地诱导出大量的猫儿屎丛生不定芽，移栽成活率高。本发明专利技术为提高猫儿屎的繁殖系数、为该物种的种质保存及其推广应用奠定了良好的基础。

In vitro culture method of cat feces

The present invention discloses a kind of immature fruit in embryo as explant, followed by callus induction, adventitious bud differentiation and adventitious bud proliferation and rooting culture decaisneainsignis regeneration plant. Before induction of callus also includes: sterilization of explants: decaisneainsignis young fruit, first soak 20 brushing surface 30min in each 100ml containing 6 10 drops of cleaning liquid, rinse with water after 1 2h, then in a sterile environment with 75% alcohol disinfection tender 30 fruit 60s, with each 100ml containing 3 tween 40 4 drops of 0.1%HgCl2 solution on the 15min and its sterilization, sterile water washed 4 6 times, each time 1 3min, and finally remove the young seeds, young embryo extrusion, using sterile water rinsing of young embryo explants obtained after. The method of the invention can induce a large number of adventitious buds with high frequency and high survival rate. The invention provides a good foundation for improving the reproduction coefficient of the cat feces, and for the germplasm conservation and the popularization and application of the species.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种猫儿屎的离体培养方法。
技术介绍
猫儿屎(Decaisnea insignis(Griff.)Hook.f.et Thoms.)是木通科(Lardizabalaceae)猫儿屎属(Decaisnea)直立落叶灌木，广泛分布于我国西南部至中部地区，生长于海拔900-3600米的山坡灌丛或沟谷杂木林下阴湿处(应俊生等，2001)。猫儿屎又名猫屎瓜，来自于其果实成熟后，为蓝紫色长条状，稍弯曲，形似猫屎(侯运和等，2011)。猫儿屎的果实为浆果，含有丰富的汁液，富含糖分，维生素和矿质营养等，可以作为水果食用，也可以用于生产果汁、酒和制糖；果皮中含有大量的橡胶成分，其比例可达10％-20％，可以用于橡胶产品的生产(侯运和等，2010)，在今天石油资源日益枯竭的情况下，猫儿屎可视为非常珍贵的一种野生橡胶植物。猫儿屎种子中富含丰富的油脂，比例大约为18％-22％，出油率与棉籽相近，且油脂成分内含有大量的不饱和脂肪酸(刘继瑞等，2011)，符合目前人们追求天然健康产品的理念，在开发药用植物油和保健品方面具有很大潜力(孙翔宇等2012)，是一种具有很高经济效益的野生油料树种。猫儿屎的根部和果实可以入药，其味甘、辛，性平，有清肺止咳，祛风除湿，润燥的功能，主要用于治疗肺结核、咳嗽、阴痒和疝气等症(胡正海等，1991)，通过小鼠体内实验表明猫儿屎茎中含有的多种化合物具有抗肿瘤的作用(孔杰，1996)，可见猫儿屎具有很高的药用价值。猫儿屎树的花期和果期均长达4个月，在4-7月份开花，7-10月为结果期，花为淡绿色，果为蓝色或蓝紫色，在园林中具有很高的欣赏性(班荔等，2014)。此外，猫儿屎的叶片和果实也是神农架川金丝猴的主要食源植物之一(铁军等，2011)。猫儿屎自身的适应能力极强，抗病虫害的能力也很突出，在其生长过程中，其根部发达，相互缠绕，地上的枝叶和茎生长茂盛，覆盖面积大，利于防止水土流失和土壤沙漠化(侯运和等，2011)。猫儿屎目前是我国尚未被开发利用的野生树种，可作为食用果树、药用果树和观赏用树种，潜在价值巨大，因此猫儿屎的引种栽培和推广利用的意义极其重大。猫儿屎主要通过扦插、压条和分株等方式无性繁殖，母树植株受野生资源的分布和数量限制难以大规模繁育；猫儿屎种子种皮富含油脂，发芽慢且不整齐，发芽率低，采用有性繁殖方法存在实生苗生长周期长，出苗率不稳定等缺陷,无法满足生产和市场的需求。因此，探索快速繁殖猫儿屎的有效途径成为亟待解决的问题。组织培养具有需要材料量少、繁殖快、不受季节影响等特点，是快速繁殖木本植物一个重要方法。近年来，对于猫儿屎的组织培养研究仅有实生无菌苗、腋芽做外植体诱导不定芽发生(杨敬天等2009；郭邦利2013)，分析了培养基的种类、植物生长调节剂的组合和配比对腋芽和不定芽的诱导影响，但繁殖系数较低。基于上述问题，迫切需要通过外植体、植物生长调节剂、基本培养基和培养条件的筛选，建立稳定高频发生猫儿屎的不定芽再生和快繁体系，提高其繁殖系数，为猫儿屎的种质资源保存、规模化繁殖、推广利用及生物技术育种提供良好的实验平台。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术再有一个目的是提供一种猫儿屎的离体培养方法。为此，本专利技术提供的技术方案为：一种猫儿屎的离体培养方法，包括：以未成熟果实的种胚作为外植体，依次经过愈伤组织的诱导、不定芽分化诱导、不定芽增殖培养和生根诱导培养获得猫儿屎再生植株。优选的是，所述的猫儿屎的离体培养方法中，在进行愈伤组织的诱导之前，还包括：外植体的灭菌：取猫儿屎幼嫩果实，首先在每100ml含6-10滴的洗洁净液中浸泡20-30min后刷洗表面，之后用水冲洗1-2h，然后在无菌环境中先用75％的酒精灭菌处理幼嫩果实30-60s，之后用每100ml含3-4滴土温40的0.1％HgCl2溶液对其灭菌15min，再用无菌水清洗4-6次，每次1-3min，最后取出幼嫩种子，挤出幼嫩种胚，使用无菌水漂洗所述幼嫩种胚后获得外植体。优选的是，所述的猫儿屎的离体培养方法中，所述愈伤组织组织的诱导中，将所述外植体置于愈伤组织诱导培养基进行诱导32天得到愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基包含：MS、0.1-2.0mg/L的6-糠基氨基嘌呤和0.5-4.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸。优选的是，所述的猫儿屎的离体培养方法中，所述不定芽分化诱导中，将愈伤组织诱导培养得到的愈伤组织置于分化培养基上诱导30天产生不定芽，所述分化培养基包含：MS、0.1-2.0mg/L的6-苄基嘌呤(6-BA)和0.01-0.5mg/L的α-萘乙酸。优选的是，所述的猫儿屎的离体培养方法中，所述不定芽增殖培养中，将不定芽分化诱导中得到的不定芽置于增殖培养基中诱导产生不定芽增殖15-30天，该增殖培养基包含：1/2MS、2.0-3.0mg/L的6-苄基嘌呤和0.2-1.0mg/L的α-萘乙酸。优选的是，所述的猫儿屎的离体培养方法中，所述生根诱导培养中，将不定芽增殖培养中产生的不定芽置于生根诱导培养基上诱导生根，得到猫儿屎再生植株，所述生根诱导培养基包含：1/2MS和0.3-0.9mg/L咧哚丁酸或1/2MS和0.3-0.9mg/L的α-萘乙酸。优选的是，所述的猫儿屎的离体培养方法中，所述愈伤组织的诱导、不定芽分化诱导、不定芽增殖培养和生根诱导培养中，培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/天，光照强度2000lux。优选的是，所述的猫儿屎的离体培养方法中，在所述生根诱导培养获得猫儿屎再生植株之后还包括：炼苗：将长至5-8cm高的猫儿屎再生植株于室外20-25℃下炼苗5-7天。优选的是，所述的猫儿屎的离体培养方法中，在所述炼苗之后还包括：移栽：将炼苗之后的猫儿屎再生植株移栽入河沙和腐质土的混合基质中进行培养，河沙和腐质土的混合比例为0.5-1:1。优选的是，所述的猫儿屎的离体培养方法中，所述未成熟果实为90天果龄的果实。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术提供了资源植物猫儿屎的一种离体培养方法。该方法是以幼嫩种胚作为外植体，通过不定芽诱导途径得到再生植株。以幼嫩种胚作为外植体进行离体再生的优势在于诱导分化能力强，长期继代培养过程不易退化。本专利技术所述方法可高频率地诱导出大量的猫儿屎丛生不定芽，经过生根后再生植株移栽成活率高，可达98％。本专利技术为提高猫儿屎的繁殖系数、为该物种的种质保存及其推广应用奠定了良好的基础，应用前景广阔。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术所述猫儿屎的幼嫩种胚诱导的初始愈伤组织的照片；图2为本专利技术所述猫儿屎的继代增殖的愈伤组织的照片；图3为本专利技术所述猫儿屎的愈伤组织分化的丛生芽的照片；图4为本专利技术所述猫儿屎的不定芽增殖获得较大幼苗的照片；图5为本专利技术所述猫儿屎较大幼苗的健壮根系的照片；图6为本专利技术所述移栽成活的猫儿屎幼苗的照片。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猫儿屎的离体培养方法，其特征在于，包括：以未成熟果实的种胚作为外植体，依次经过愈伤组织的诱导、不定芽分化诱导、不定芽增殖培养和生根诱导培养获得猫儿屎再生植株。

【技术特征摘要】
1.一种猫儿屎的离体培养方法，其特征在于，包括：以未成熟果实的种胚作为外植体，依次经过愈伤组织的诱导、不定芽分化诱导、不定芽增殖培养和生根诱导培养获得猫儿屎再生植株。2.如权利要求1所述的猫儿屎的离体培养方法，其特征在于，在进行愈伤组织的诱导之前，还包括：外植体的灭菌：取猫儿屎幼嫩果实，首先在每100ml含6-10滴的洗洁净液中浸泡20-30min后刷洗表面，之后用水冲洗1-2h，然后在无菌环境中先用75％的酒精灭菌处理幼嫩果实30-60s，之后用每100ml含3-4滴土温40的0.1％HgCl2溶液对其灭菌15min，再用无菌水清洗4-6次，每次1-3min，最后取出幼嫩种子，挤出幼嫩种胚，使用无菌水漂洗所述幼嫩种胚后获得外植体。3.如权利要求1所述的猫儿屎的离体培养方法，其特征在于，所述愈伤组织组织的诱导中，将所述外植体置于愈伤组织诱导培养基进行诱导32天得到愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基包含：MS、0.1-2.0mg/L的6-糠基氨基嘌呤和0.5-4.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸。4.如权利要求1所述的猫儿屎的离体培养方法，其特征在于，所述不定芽分化诱导中，将愈伤组织诱导培养得到的愈伤组织置于分化培养基上诱导30天产生不定芽，所述分化培养基包含：MS、0.1-2.0mg/L的6-苄基嘌呤(6-BA)和0.01-0.5mg/L的α-萘乙酸。5.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁宏伟，陈发菊，魏文桃，陈芸芸，杨敬元，杨林森，
申请(专利权)人：三峡大学，湖北神农架国家级自然保护区管理局，
类型：发明
国别省市：湖北;42