本发明专利技术公开了高产麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明专利技术以pPIC3.5k为载体，以Pichia pastoris KM71为表达宿主，表达Sulfolobus acidocaldarius来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶，得到重组菌pPIC3.5k‑treY/P.pastoris。发酵产麦芽寡糖基海藻糖合成酶活可达3128.7U·mL‑1，远高于本发明专利技术构建的其他重组毕赤酵母或者大肠杆菌，具有工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高产麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程
技术介绍
海藻糖(Trehalose)是由两个吡喃环葡萄糖以1,1-糖苷键连结而成，是一种稳定的非还原性二糖，它有3种光学异构体，即αα型、αβ型和ββ型。海藻糖是一种安全的非还原性二糖，广泛存在于自然界中，具有保湿性，抗冻抗干燥性，热酸稳定性等特殊的生物学功能，对生物大分子有着非特异性的保护作用，因此在医学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大。自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。酶法转化生产海藻糖是上世界90年代逐渐兴起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。当前以淀粉为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生成海藻糖，即双酶法生产海藻糖，受到广泛关注。以该方法生产海藻糖的转化率高达80％以上，在一定程度上降低了海藻糖的生产成本并极大的推动了海藻糖的工业化生产进程。麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)于1990年由意大利的Lama等人在硫矿硫化叶菌(Sulfolbus solfatarius)MT4的无细胞匀浆中发现，它是一种合成酶，作用于麦芽寡糖的还原性末端，将α-1,4-糖苷键转化为α，α-1,1-糖苷键，它能够麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohyrolase,MTHase,3.2.1.141)复配合成海藻糖。淀粉经过高温液化后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精，麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α,α-1,4-糖苷，产生α,α-1,4-糖苷键到α,α-1,1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖。麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行，两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成海藻糖为主，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。双酶法生产海藻糖以淀粉为底物，转化率高达80％以上，具有低成本的优点，但是麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在宿主菌中的可溶性表达很低，产生较多的包涵体，酶活力低，不利于其工业化应用。
技术实现思路
本专利技术第一个目的是构建一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌，以pPIC3.5k为载体，以Pichiapastoris KM71为表达宿主；表达Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，得到重组菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris。本专利技术的第二个目的是提供一种所述的基因工程菌的构建方法是以pPIC3.5k载体，以Pichiapastoris KM71为表达宿主；表达Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶，得到重组菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris。本专利技术的第三个目的是提供一种所述基因工程菌发酵生产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法。在本专利技术的一种实施方式中，将基因工程菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris活化后，接入发酵培养基，并添加甲醇诱导麦芽寡糖基海藻糖水解酶的表达，收集细胞，从细胞破壁上清液中收集得到麦芽寡糖基海藻糖水解酶。在本专利技术的一种实施方式中，配0.9L发酵培养基置入3L发酵罐中，于28-32℃，调节pH至5.0并校准溶氧，将基因工程菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris活化后的种子液，控制溶氧在28-32％左右，将转速和通气偶联，确保溶氧稳定。待甘油消耗完毕，溶氧将发生反弹，此时开始流加甘油，流加速率为2.2g/min，至细胞浓度为OD600为150时停止，饥饿1-2h后，流加甲醇，使其体积终浓度维持在1.5％，于30℃开始诱导产酶。所述发酵培养基按g/L计含有：MgSO4·7H2O 14.9，KOH 4.13，甘油30.0，CaSO40.93，K2SO418.2，85％磷酸26.7，微量盐溶液4.35；微量盐溶液：CuSO4·5H2O 6，ZnCl220，Na2MoO3·2H2O 0.2，CoCl20.5，KI 0.08，MnSO4·H2O 3，H3BO30.02，FeSO4·7H2O 65，H2SO45.0，生物素0.2。本专利技术构建的基因工程菌Ppic3.5k-treY/Pichiapastoris发酵产麦芽寡糖基海藻糖合成酶活可达3128.7U·mL-1，远高于本专利技术构建的其他重组毕赤酵母或者大肠杆菌，具有工业应用价值。附图说明图1、重组菌pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)破壁上清(摇瓶)与破壁沉淀(摇瓶)SDS-PAGE电泳图。泳道1：5OD重组菌pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)破壁上清；泳道2：5OD重组菌pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)破壁沉淀。图2、重组菌pET-32a(+)-treY/E.coli Origami(DE3)破壁上清与破壁沉淀SDS-PAGE电泳图，包括重组菌pET-24a(+)-treY/E.coli BL21(DE3)破壁上清与破壁沉淀的对照。M:proteinmarker；1：E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-treY破壁上清；2：E.coli Origami(DE3)/pET-32a(+)-treY破壁上清；3：E.coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-treY cell-extrac破壁沉淀；4：E.coliOrigami(DE3)/pET-32a(+)-treY cell-extract破壁沉淀。图3、重组菌pSVN-treY/B.brevis破壁上清SDS-PAGE电泳图。图4、重组菌pPic3.5k-treY/Pichiapastoris、pGAPZA-treY/P.pastoris、pGAP3.5k-treY/P.pastoris破壁上清SDS-PAGE电泳图。1：重组菌Ppic3.5k-treY/Pichiapastoris；2：pGAPZA-treY/Pichiapastoris；3：pGAP3.5k-treY/Pichiapastoris；4：破壁上清SDS-PAGE电泳图。图5、重组菌pPic3.5k-treY/Pichiapastoris3L发酵罐发酵产酶曲线；(1)初始诱导OD600对产酶影响；(2)诱导温度对产酶影响；(3)诱导甲醇浓度对产酶影响。具体实施方式培养基：1、重组菌pSVN-treY/B.brevis与重组菌pET-32a(+)-treY/E.coli Origami(DE3)相关培养基：(1)LB固体培养基的组成为：分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌，其特征在于，以pPIC3.5k为载体，以Pichia pastoris KM71为表达宿主，表达Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶，得到重组菌pPIC3.5k‑treY/P.pastoris。
【技术特征摘要】
1.一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌，其特征在于，以pPIC3.5k为载体，以Pichia pastoris KM71为表达宿主，表达Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶，得到重组菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris。2.根据权利要求1所述的的基因工程菌，其特征在于，编码所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因treY的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.一种制备权利要求1或2所述的基因工程菌的方法，其特征在于，是以pPIC3.5k为载体，以Pichia pastoris KM71为表达宿主；表达Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶，得到重组菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以携带编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因的重组载体pET-24a(+)-treY为模版扩增得到带有EcoR I和Not I两个酶切位点的目的基因，然后与T载连接，克隆后与pPIC3.5K进行双酶切并连接；将重组质粒通过Sac I酶进行线性化后转入酵母细胞，得到重组菌pPIC3.5k-treY/P.pastoris。5.一种应用权利要求1或2所述的基因工程菌发酵生产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，将基因工程...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，韩唱，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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