SH3结构域非典型配体及其制备方法技术

本发明专利技术针对SH3结构域非典型配体分离鉴定的技术难题，提供一种SH3结构域非典型配体的制备方法，具体包括构建简并随机肽库、构建重组SH3结构域表达载体、肽库选择、阳性克隆测序、序列多重比对分析、配体基序验证等。本发明专利技术通过实施上述方法，制备了一系列SH3结构域非典型配体，确定其保守基序为LxLLFF，进而通过免疫沉淀和免疫印迹证实了非典型配体肽与SH3结构域在细胞内相互结合。本发明专利技术所述方法及获得的配体为SH3结构域的功能研究、及以构效关系为基础的药物设计等提供依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别是涉及通过肽库技术研究蛋白质相互作用以获得SH3结构域的非典型配体及配体的保守基序。
技术介绍
SH3结构域在细胞内广泛分布，通常由50～100个氨基酸组成，SH3结构域是一种参与调节多生物过程的重要蛋白质相互作用结构域。最初是在v-Src癌基因酪氨酸激酶产物的同源序列中发现该结构域，现已知SH3结构域在许多信号分子和细胞骨架分子中存在。典型的SH3结构域是由五条β折叠，RT loop，N-Src loop，the distal loop和一个310 helix组成。SH3结构域在细胞增殖分化的信号通路中发挥作用，被作为不同类型的癌症研究药物靶点。SH3结构域的典型配体，包含-P-x-x-P-序列，加上两端的辅助结合位点形成RXXPXXP，PXXPXR的结合基序。目前SH3结构域在药物发现中的研究主要集中在结构相对单一的典型配体。近年来随着对SH3结构域的深入研究，一些SH3结构域的非典型配体相继被报道发现，例如：RKxxYxxY区域与Fyb，Fyn和Lck蛋白的SH3结构域结合。WxxxFxxLE区域与Pex13p蛋白的SH3结构域结合。这些SH3结构域非典型配体的发现一方面表明SH3结构域的功能存在多样性，另一方面也为以SH3结构域活性为对象的癌症药物靶点研究提供基础和依据。然而，由于SH3结构域典型配体的丰度高、分布广、亲和力强，因此在常规的高通量、大规模筛选过程中，获得的SH3结构域配体绝大多数均为典型配体，很难发现SH3结构域的非典型配体，更难以发现SH3结构域配体的保守基序，因此目前关于SH3结构域非典型配体的报道较少，制约了SH3结构域及其配体的用途。
技术实现思路
针对上述现有技术中的不足，本专利技术提供一种SH3结构域非典型配体及其制备方法。具体而言：本专利技术提供一种SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征包括以下步骤：步骤一：构建密码子简并的随机肽库；步骤二：构建SH3结构域表达载体，转入宿主细胞；步骤三：肽库选择，获得能够结合SH3结构域的肽；步骤四：序列比对，获得SH3结构域配体的肽基序；步骤五：基序验证，挑选含有所述肽基序的典型阳性肽验证其与SH3结构域的结合能力。本专利技术所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤一进一步包括：(1)简并密码子和简并反密码子设计：使密码子符合以下通式5’-3’：N1-N2-N3，其中，N1选自A、T、G，N2选自A、T、C、G，N3选自C、G；或N1选自A、T、C、G，N2选自A、T、G，N3选自C、G；使反密码子符合以下通式5’-3’：N3’-N2’-N1’，其中，N3’选自C、G，N2’选自A、T、C，N1’选自A、T、C、G；(2)肽库编码区的人工合成，人工合成以下两条序列序列1：TATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCGGA-(N1-N2-N3)8-TAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAG；序列2：GATCCTACTACTACTACTACTACTACTA-(N3’-N2’-N1’)8-TCCGAATTCACTGGCCTCCATGGCCA(3)将序列1、2退火后插入pGADT7载体的NdeI和BamHI之间，获得上述随机8肽的融合表达载体；(4)将步骤(3)中的表达载体转化感受态大肠杆菌，获得8肽库；(5)对8肽库的容量和重组率进行鉴定，测得库容达到107级以上，重组率达到90％以上，确定为合格。本专利技术所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤二进一步包括：(1)将SH3结构域序列插入pBridge质粒的EcoRI和BamHI之间，所述SH3结构域选自由hNCK-NSH3、hNCK-MSH3、hFynTSH3、cSpectrinSH3、hFgrSH3、hAb1SH3、mGadsCSH3、hGrb2CSH3、cSrcSH3组成的组；(2)将表达SH3结构域的重组pBridge质粒转化于酵母感受态细胞中，筛选获得重组酵母菌。本专利技术所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤三进一步包括：(1)从步骤一获得的随机肽库扩增后，提取并纯化质粒；(2)用步骤二获得的重组酵母制备感受态细胞，用步骤(1)获得的质粒进行转化，抗性筛选阳性克隆；(3)对步骤(2)获得的阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测；(4)β-半乳糖苷酶活阳性的克隆，提质粒、测序；(5)对测序结果进行分析，获得结合SH3结构域的8肽序列。本专利技术所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤四进一步包括：使用序列分析软件，对步骤三获得的多个8肽序列进行分析比对，获得SH3结构域配体的肽基序。所述的序列分析软件包括DNASTAR、DNAMAN等。本专利技术所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤五进一步包括：(1)从步骤三获得的阳性8肽序列中选择具有SH3结构域配体肽基序的8肽序列，或人工设计具有步骤四所述配体基序的短肽序列；(2)将所述8肽序列或人工设计的短肽序列插入载体中，使其与SH3结构域在同一个宿主中共表达，验证两者的相互作用。其中，所述人工设计的短肽序列长度为6-20个氨基酸，优选8个氨基酸。本专利技术还提供一种利用所述方法制备获得的SH3结构域非典型配体。本专利技术所述SH3结构域非典型配体具有LxLLFF所示的多肽基序，其中x为天然氨基酸。优选，所述SH3结构域非典型配体具有CILWLLFF的氨基酸序列。另外，本专利技术还提供所述的SH3结构域非典型配体在促进或抑制SH3结构域功能中的用途。本专利技术取得的技术效果在于：提供了一种简并化肽库的构建和使用方法，成功获得了一系列结构相似的SH3结构域非典型配体，分析出了SH3结构域非典型配体的基序LxLLFF。从而为SH3结构域的作用机理、功能研究、及以构效关系为基础的药物设计等提供依据。附图说明图1：库容测量试验中当稀释度为104时的平板计数情况；图2：肽库选择阳性配体(有两条相同，只显示了9条)的序列比对情况及SH3结构域配体基序分析；图3：WB检测鉴定结果。泳道1为阴性对照组(pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空载体)；泳道2为实验组(pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-CILWLLFF)。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。所述实施例的内容仅用于说明本专利技术，并不意味着对本专利技术的保护范围作出限定。实施例一：肽库的构建1.人工合成序列1、2所示的核酸，退火成双链。1)在0.5ml离心管中配制下列反应液Oligo各取500pmol，在1×Annealing Buffer中，95度水浴10分钟，自然降温使之复性形成双链，形成粘性末端(NdeI和BamHI)。表1退火反应体系1×Annealing Buffer20μlOligo500pmolddH20至总体积20μl2)酶切产物用等体积的酚/氯仿抽提一次，10,000rpm离心2min，吸上清于另一管中；3)估计上清的体积，加入1/10体积的NaAc(3M)溶液，然后加入2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃沉淀10min；4)4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤两遍；5)室温干燥沉淀，然后溶于适量ddH20中。用紫外分光光度计测量所得DNA的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：构建密码子简并的随机肽库；步骤二：构建SH3结构域表达载体，转入宿主细胞；步骤三：肽库选择，获得能够结合SH3结构域的肽；步骤四：序列比对，获得SH3结构域配体的肽基序；步骤五：基序验证，挑选含有所述肽基序的典型阳性肽验证其与SH3结构域的结合能力。

【技术特征摘要】
1.一种SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：构建密码子简并的随机肽库；步骤二：构建SH3结构域表达载体，转入宿主细胞；步骤三：肽库选择，获得能够结合SH3结构域的肽；步骤四：序列比对，获得SH3结构域配体的肽基序；步骤五：基序验证，挑选含有所述肽基序的典型阳性肽验证其与SH3结构域的结合能力。2.如权利要求1所述SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于：所述步骤一包括：(1)简并密码子和简并反密码子设计：使密码子符合以下通式5’-3’：N1-N2-N3，其中，N1选自A、T、G，N2选自A、T、C、G，N3选自C、G；或N1选自A、T、C、G，N2选自A、T、G，N3选自C、G；使反密码子符合以下通式5’-3’：N3’-N2’-N1’，其中，N3’选自C、G，N2’选自A、T、C，N1’选自A、T、C、G；(2)肽库编码区的人工合成，人工合成以下两条序列序列1：TATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCGGA-(N1-N2-N3)8-TAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAG；序列2：GATCCTACTACTACTACTACTACTACTA-(N3’-N2’-N1’)8-TCCGAATTCACTGGCCTCCATGGCCA(3)将序列1、2退火后插入pGADT7载体的NdeI和BamHI之间，获得上述随机8肽的融合表达载体；(4)将步骤(3)中的表达载体转化感受态大肠杆菌，获得8肽库；(5)对8肽库的容量和重组率进行鉴定，测得库容达到107级以上，重组率达到90％以上。3.如权利要求1所述SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于：所述步骤二包括：(1)将SH3结构域序列插入pBridge质粒的EcoRI和BamHI之间，所述SH3结构域选自由hNCK-NSH3、hNC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李嫄，高友鹤，宋春霞，杨帆，马素参，
申请(专利权)人：李嫄，
类型：发明
国别省市：北京;11