本发明专利技术提供一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的方法，其中使用的正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2，探针的序列为SEQ ID NO:3；本发明专利技术使用real‑time RPA方法检测食源性致病菌副溶血性弧菌的检测方法，以实现对副溶血性进行安全、特异、快速、灵敏、简单的现场快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法适用于现场检测，能够及时、有效的抑制副溶血性弧菌食物中毒引发疫情的发生，完善食品安全保障体系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病害微生物检测
，具体涉及一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的方法。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)属细菌界(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、弧菌目(Vibrionales)、弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)，为一种革兰氏阴性嗜盐菌，它主要感染生活在温暖、含盐高的河流或海域口的水生生物上，具有较强的致病性，是主要的食源性致病菌之一。人类如果误食被其感染的海产品，会出现腹泻、腹痛、肠痉挛、恶心、呕吐和水样便等肠胃炎反应，严重时会引起全身痉挛和肾功能衰竭等临床反应。该菌最先由日本的Fujino等从食物中毒病患中分离得到，具鞭毛，无荚膜，体内无芽孢，为多形态杆菌。随着近年来海鲜贸易的全球化，由其引起的中毒事件发生比率逐年上升。现阶段研究表明，副溶血性弧菌产生耐热性直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、TDH相关溶血素(TDH related hemolysin,TRH)和不耐热性溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)三种重要的溶血素。通常副溶血弧菌临床分离株产生耐热性直接溶血素和耐热性直接溶血素相关溶血素，有研究表明，VP引起的胃肠炎与这两种溶血素有密切的关系，因此，一般认为TDH和TRH是副溶血弧菌的主要致病因子。TLH是一种非典型磷脂酶，能溶解动物的红细胞。国标检测方法仍是细菌培养的微生物学方法，分为增菌、分离、鉴定和血清学鉴定。该方法操作复杂，需经过一定的培养时间才能得到检测结果。目前研究的方法有：①免疫法，如酶联免疫吸附、免疫胶体金技术等；②分子生物法：如PCR、实时荧光PCR、巢氏PCR、LAMP、核酸探针方法、基因芯片技术等；③变性高效液相色谱等等。国标中针对以上几种食源性致病菌采用的是比较传统的微生物学方法，这些方法不适合应用在快速检测上。而另一方面，兴起的免疫学方法和分子生物学检测方法常具有仪器依赖性、检测成本高、技术要求严苛，使得这些看似灵敏、特异、高效的方法不能得到广泛应用和市场中的普及。因此亟需寻找一种能够在这两方面实现方法学和经济性平衡的适用于现场检测的新技术，第一时间检测致病菌，以便及时采取措施来去除和减少以降低消费者食用这些被微生物污染产品的风险，对食品安全具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的方法，即一种使用real-time RPA方法检测食源性致病菌副溶血性弧菌的检测方法，以实现对副溶血性进行安全、特异、快速、灵敏、简单的现场快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法适用于现场检测，能够及时、有效的抑制副溶血性弧菌食物中毒引发疫情的发生，完善食品安全保障体系。本专利技术首先提供一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的引物组，其序列信息如下：正向引物F-RPA:5′-TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACG-3′(SEQ ID NO:1)反向引物R-RPA:5′-AGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGA-3′(SEQ ID NO:2)本专利技术还提供用于配合上述引物组使用的探针，其序列信息如下：探针p:5′-TTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGAT-3’(SEQ ID NO:3)其中探针P的第30位碱基T进行羧基荧光素FAM标记，第33位碱基T进行BHQ(Black Hole Quencher染料)标记，以及第31位碱基C用脱碱基位点类似物THF替代。上述的引物组和探针用于制备检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的制品；本专利技术另一个方面提供一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus方法，包括如下的步骤：1)配制RPA反应体系：各引物的终浓度为：引物F-RPA和引物R-RPA各420nmol/μL；探针P 120nmol/μL；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH7.9)50mmol/μL、KAc(醋酸钾)100mmol/μL,DTT(二硫苏糖醇)2mmol/μL，5％PEG 20mol/μL，dNTPs 200μmol/μL,ATP 3mmol/μL，pcr(磷酸肌酸激酶)50mmol/μL，CK(肌酸激酶)100ng/μL，DNA聚合酶Bsu 30ng/μL，单链绑定蛋白Gp32 300ng/μL，重组酶UvsX 240ng/μL，辅助酶UvsY 60ng/μL，核酸外切酶exo 200ng/μL；样品DNA模板适量，加双蒸水使未反应的混合体系(reaction mix)体积为23.75μL；280mmol/μL MgAc(醋酸镁)1.25μL，使反应体系总体积为25μL；2)RPA反应体系扩增：无菌1.5mL离心管中依次加入除醋酸镁和模板DNA以外的所有反应组分，振荡后离心；加入适量模板DNA，振荡后离心；将reaction mix用微量移液器转移至无菌荧光定量专用加样管中，加入280mmol/μL MgAc(醋酸镁)1.25μL于专用管配套的透明盖子上，盖上盖子，离心；摇晃10次，离心；3)荧光产物检测：本专利技术中选用的荧光定量仪是德国Roche公司的96System。显示屏上预先设置好反应程序，包括反应温度，反应体积，探针发光信号对应的荧光素。反应过程每30s采集一次信号，记作反应的一个循环。完成加样后，迅速将样品加入到仪器的96孔板适合的位置上，并在控制主界面点击开始按钮，反应开始，仪器将自动按设置采集荧光信号。本专利技术所提供的检测引物组及方法具有如下优点：一、高灵敏度，对副溶血性弧菌的检测最低线可至0.4pg/μL。二、强特异性，根据副溶血性弧菌的不耐热性溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)编码基因tlh进行设计特异性引物，实验证明检测特异性强。三、检测时间较短，15分钟左右可获得检测结果，与常规检测方法相比具有相当大的优势。四、仪器设备要求低，不需要温度循环器、PCR仪、电泳仪或凝胶成像系统，只需一个便携式荧光检测仪即可完成检测。五、操作简便、结果呈现明显，整个检测过程不涉及复杂昂贵仪器和设备，样品前处理简单，无需进行DNA纯化，煮沸法粗提取的DNA便可以达到检测要求，稍具有分子生物学基础的人员即可完成整个操作；扩增产物与荧光信号同步积累，实现实时监测，省去了后续的扩增结果检测步骤，减少检测时间。六、对实验人员和环境更安全，检测过程不需要进行凝胶电泳故不使用EB等有毒试剂。附图说明图1：副溶血性弧菌的real-time RPA引物和探针设计示意图，引物由方框圈出，探针由斜体并加粗表示，探针中的修饰位点由下划线表示。图2：扩增的标准曲线图；图3：特异性检测图。具体实施方式RPA技术，全称为重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplifi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的引物组，其特征在于，所述的引物组中引物的序列信息如下：正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
【技术特征摘要】
1.一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的引物组，其特征在于，所述的引物组中引物的序列信息如下：正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。2.一种用于配合权利要求1所述引物组使用的探针，其特征在于，所述的探针的序列为SEQ ID NO:3。3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，所述的探针的第30位碱基T进行羧基荧光素FAM标记，第33位碱基T进行BHQ标记，第31位碱基C用脱碱基位点类似物THF替代。4.权利要求1所述引物组和权利要求2或3所述的探针在制备检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus的制品中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的制品为检测试剂盒。6.一种检测副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)配制RPA反应体系：各引物的终浓度为：权利要求所述的正向引物F-RPA和反向引物各420nmol/μL；权利要求2所述的探针120nmol/μL；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl50mmol/μL、KAc 100mmol/μL,DTT 2mmol/μL，5％PEG 20mol/μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱鹏，高威芳，严小军，黄海龙，朱竹君，李艳荣，牟桐，
申请(专利权)人：宁波海洋研究院，宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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