CCM3基因敲除小鼠模型的建立方法及用途技术

本发明专利技术公开了CCM3基因敲除小鼠模型的建立方法，包括：通过交配CCM3lox/lox小鼠与他莫昔芬诱导Cdh5CreERT2的敲除小鼠，获得他莫昔芬诱导的血管内皮细胞特异性的CCM3基因敲除小鼠模型。本发明专利技术的小鼠模型经过他莫昔芬诱导后具有人脑海绵状血管畸形的病理特点，非常适合用于人脑海绵状血管畸形发病机制研究和开发相应的治疗药物和治疗方法，也可用于药物的药效观察和药效评价。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，尤其涉及CCM3基因敲除小鼠模型的建立方法及用途。
技术介绍
脑海绵状血管畸形(cerebral carvernoμs malformation,CCM)是发生在中枢神经系统的一种血管错构畸形，是先天性脑血管畸形的一种,约占脑血管畸形的10％～20％,人群患病率约0.1％～4％。CCM，外观紫红色,剖面呈海绵状或蜂窝状,由不规则的、大小不等的血管腔隙聚集成海绵状异常血管团,管腔1～10mm不等,内壁为一层扁平内皮细胞,血管腔隙之间无神经组织,只有少量结缔组织。肉眼下CCM是一团堆积的薄壁血管腔,呈桑葚状,边界清楚,可见含铁血黄素沉着。镜下可见其由许多不规则,异常扩大的窦状血管间隙和玻璃样胶原基质构成,无平滑肌及弹力纤维,血管腔内面附有单层扁平内皮细胞,无基膜,血管间仅少量结缔组织,病灶内反复出血,血管腔机化血栓,钙化及血管再通,周围有含铁血黄素沉积及胶质增生。大多数CCM累及中枢神经系统,但也可见于视网膜、皮肤等其它器官。该病临床症状隐袭,主要表现为头痛、痫性发作、颅内出血和局部神经功能障碍。CCM分为散发性和常染色体显性遗传,遗传性CCM与3个致病基因种系突变相关,包括CCM1(KRIT1,7q11.2-q21)、CCM2(MGC4607、7p15-p13)和CCM3(PDCD10、3q25.2-q27)。90％以上的CCM病人携带这3个致病基因的突变。近十几年来,3个CCM致病基因种系突变的研究报道非常多。由于CCM病灶组织内体细胞基因突变的发现提出了“二次打击”机制(two-hit mechanism)学说,认为其参与了脑海绵状血管瘤的发病机制,导致表达于脑海绵状血管瘤毛细血管腔内皮细胞的致病基因编码蛋白完全失去功能。这种学说最近已经在小鼠动物模型中被证实，虽然CCM发病机制尚不清楚,但分子遗传学研究为我们深入理解CCM的发病机制和临床治疗提供了重要依据。鉴于目前缺乏有效的治疗药物，手术切除是CCM的唯一治疗手段，因此，研究CCM的发病机制和寻找新的有效药物或治疗方法是当前的研究热点。研究CCM的发病机制和探索有效的治疗药物或方法都需要建立一个合适的实验动物模型。CCM1，CCM2，CCM3是目前已发现的CCM致病基因，但是内皮细胞特异性敲除CCM1，CCM2，CCM3的小鼠由于血管发育异常往往导致胚胎致死，无法用于CCM发病机制和治疗方法或药物的研究。
技术实现思路
一方面，本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了CCM3基因敲除小鼠模型的建立方法，本专利技术的小鼠模型经过他莫昔芬诱导后具有人脑海绵状血管畸形的病理特点，非常适合用于人脑海绵状血管畸形发病机制研究和开发相应的治疗药物和治疗方法，也可用于药物的药效观察和药效评价。本专利技术采用的技术方案为：一种CCM3基因敲除小鼠模型的建立方法，包括：通过交配CCM3lox/lox小鼠与他莫昔芬诱导Cdh5CreERT2的敲除小鼠，获得他莫昔芬诱导的血管内皮细胞特异性的CCM3基因敲除小鼠模型。作为对上述技术方案的进一步改进，所述方法还包括以下步骤：所述他莫昔芬诱导的血管内皮细胞特异性的CCM3基因敲除小鼠出生后，给小鼠喂养他莫昔芬，该小鼠即发展为具有CCM病变表型的CCM3基因敲除小鼠模型(Ccm3lox/lox:Cdh5-CreERT2，简称为Ccm3-iecKO)。作为对上述技术方案的进一步改进，他莫昔芬诱导的血管内皮细胞特异性的CCM3基因敲除小鼠出生后1至3天，给小鼠喂养他莫昔芬。作为对上述技术方案的更进一步改进，按每克小鼠体重10μg的剂量给小鼠喂养他莫昔芬。选择此剂量是为了达到最好的敲除效果，且此剂量的它莫西芬本身对正常鼠的体重和发育等不造成影响。作为对上述技术方案的更进一步改进，给小鼠喂养他莫昔芬采用以下步骤实施：用玉米油把它莫西芬配成浓度为10mg/mL的液体给小鼠喂养。另一方面，本专利技术还提供了所述的CCM3基因敲除小鼠模型作为脑海绵状血管瘤发病机制、治疗方法或药物研究中的小鼠模型的用途。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术建立的CCM3基因敲除小鼠模型采用他莫昔芬诱导的形式，克服了基因敲除CCM致病基因导致的胚胎致死问题；经过他莫昔芬诱导，本模型在出生后第五天即可在小脑观察到膨大的毛细血管，第10天可观察到明显的血管损伤，通过分析大脑组织神经血管单元、血管完整性和血脑屏障(BBB)功能的病理性改变，证实该小鼠模型与临床表型高度一致。因此，这个模型具有人脑海绵状血管畸形的病理特点，非常适合用于人脑海绵状血管畸形发病机制研究和开发相应的治疗药物和治疗方法，也可用于药物的药效观察和药效评价。附图说明图1显示了诱导型的血管内皮细胞特异性CCM3基因敲除小鼠快速出现脑和视网膜CCM病变表型；野生型(WT)和诱导型的血管内皮细胞特异性CCM3基因敲除(Ccm3-iecKO)小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，在P2-P10天取脑组织进行检测；其中，A显示了P2，P5，P10天的WT和Ccm3-iecKO小鼠脑组织切片HE染色结果；B显示了P2，P5，P10天的WT和Ccm3-iecKO小鼠脑组织总CCM病灶数量统计结果；C显示了P2，P5，P10天Ccm3-iecKO小鼠脑组织CCM不同大小病灶数量统计结果。图2显示了CCM病变部位血管渗漏；其中，A显示了P10天的WT和Ccm3-iecKO小鼠新鲜脑组织；B-D显示了P10天的小鼠用FITC-葡聚糖灌注后进行免疫荧光检测结果，B为脑组织荧光图，箭头指示血管渗漏；C为CD31染色图，箭头表示正常脑组织结构，星号*显示CCM病灶；D为伊文思蓝白蛋白检测评价小鼠血脑屏障渗透性。图3显示了Ccm3-iecKO小鼠视网膜病变；对P10天的WT和Ccm3-iecKO小鼠视网膜组织的CD31和isolectin蛋白进行免疫荧光染色，放大倍数A为20X，B为80X，星号*显示CCM病变部位呈海绵状异常血管团，C显示了损害区域占比。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例中未进行详细描述的方法均可通过常规试验操作方法实施。它莫西芬(tamoxifen)，也即他莫昔芬；Ccm3与CCM3可替换使用；Cdh5-CreERT2转基因小鼠与他莫昔芬诱导Cdh5CreERT2的敲除小鼠可替换使用；Px天也即第x天。1、材料与方法1.1它莫西芬诱导的血管内皮细胞特异性的Ccm3基因敲除鼠(Ccm3-iecKO)模型为了便于通过Cre-LoxP系统研究Ccm3在血管内皮细胞中的功能，我们使用Cdh5-CreERT2转基因小鼠。Cdh5-CreERT2转基因技术原理是，首先将雌激素受体(ER)的配体结合域(LBD)突变，进而使其与Cre重组酶融合产生一个嵌合重组酶(Cre-ER)，该酶活性依赖于它莫西芬的存在，而不受体内雌激素的影响。通过利用Cdh5基因的启动子驱动Cre重组酶基因在血管内皮细胞中的表达。该转基因小鼠若服用它莫西芬，Cre重组酶的活性被激活，即可导致Cre介导的重组在预定时间内和特定的组织细胞类型(这里是指血管内皮细胞)上发生。Cdh5-CreERT2转基因小鼠的获取也可参考已报道的文献(可参见本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CCM3基因敲除小鼠模型的建立方法，其特征在于：包括：通过交配CCM3lox/lox小鼠与他莫昔芬诱导Cdh5CreERT2的敲除小鼠，获得他莫昔芬诱导的血管内皮细胞特异性的CCM3基因敲除小鼠模型。

【技术特征摘要】
1.一种CCM3基因敲除小鼠模型的建立方法，其特征在于：包括：通过交配CCM3lox/lox小鼠与他莫昔芬诱导Cdh5CreERT2的敲除小鼠，获得他莫昔芬诱导的血管内皮细胞特异性的CCM3基因敲除小鼠模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：所述他莫昔芬诱导的血管内皮细胞特异性的CCM3基因敲除小鼠出生后，给小鼠喂养他莫昔芬，该小鼠即发展为具有CCM病变表型的CCM3基因敲除小鼠模型。3.根据权利要求2所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，周焕娇，
申请(专利权)人：广州道瑞医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44