本发明专利技术公开了一种新型的NKT细胞培养方法，该方法包括NKT原代细胞培养和NKT细胞继代培养，所述NKT原代细胞培养是采用外周血单个核细胞接种无血清培养基，所述继代培养的第一天向无血清培养基中加入启动因子人源化的CD3单抗、人源化的CD28单抗和IL‑2；随后在后续的扩增液中加入扩增因子IL‑2和IL‑7。本发明专利技术公开的NKT细胞培养方法培养的NKT细胞，细胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，可以获得更高纯度的NKT效应细胞，得到的NKT细胞杀伤效果也明显高于现有的培养方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学
，具体涉及一种新型的NKT细胞培养方法。
技术介绍
细胞免疫治疗是一种新兴的治疗技术。细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成百倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。细胞免疫治疗可以恢复与增强肿瘤患者自身的免疫监测和杀瘤功能，有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的，具有特异性强、副作用轻等优点。NKT细胞是免疫细胞治疗中非常重要的一类细胞群。NKT(natural killer T)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群，可分泌大量的IL-4和IFN-γ因子，是免疫调节和细胞杀伤性作用的重要细胞群。NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NKT细胞敏感的靶细胞，主要效应分子是穿孔素、Fas配体和IFN-γ。目前NKT细胞作为具有强力杀伤靶细胞的一类细胞群，在肿瘤免疫细胞治疗中具有非常重要的作用。经体外培养得到的NKT细胞能很好的起到肿瘤免疫治疗和保健作用。在NKT细胞常规培养中，主要是利用培养瓶或培养袋按一定细胞密度直接进行培养，具体培养方法是：普通培养瓶用包被液(Anti-CD3蛋白)包被；外周血分离单个核细胞(PBMC)，经磁珠分选获得NKT细胞，接种至经包被后的培养瓶中；培养14天收集NKT细胞。然而传统培养瓶培养NKT细胞，部分细胞很容易贴壁。当细胞增殖培养时，大量的成团细胞很容易沉于底部，易导致NKT细胞不能充分接触培养液，减缓细胞增殖，并且容易使成团的细胞死亡。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种新型的NKT细胞培养方法。该培养方法采用从病人自体外周血细胞分离得到的单个核细胞，经体外操作及其相关细胞因子的刺激活化作用使其转变成高效的NKT细胞，用于肿瘤细胞的杀伤作用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：首先提供了一种新型的NKT细胞培养方法，该方法包括NKT原代细胞培养和NKT细胞继代培养，其中，所述NKT原代细胞培养是采用外周血单个核细胞接种无血清培养基，所述继代培养的第一天向无血清培养基中加入启动因子人源化的CD3单抗、人源化的CD28单抗和IL-2；随后在后续的扩增液中加入扩增因子IL-2和IL-7。优选的，所述单个核细胞接种无血清培养基的接种量为0.5-2×106个/mL。优选的，人源化的CD3单抗的终浓度为50-500ng/mL，人源化的CD28单抗的终浓度为50-500ng/mL和IL-2的终浓度为2000-5000IU/mL。优选的，所述扩增液为无血清培养基，所述IL-2的终浓度为500-1000IU/mL，IL-7的终浓度为10-50ng/mL。优选的，NKT原代细胞培养的无血清培养基中加入IFN-γ，该IFN-γ的终浓度为500-2000IU/mL的。优选的，所述继代培养的培养周期为14天以上。培养14天的NKT细胞进行肿瘤细胞的杀伤试验(杀伤选择的细胞系为：MCF-7,乳腺癌的细胞系)，使用CCK-8试剂盒的方法进行杀伤试验，NKT细胞在第14天的杀伤率即可达到80％以上。本专利技术所述培养方法中所述单个核细胞可以由外周血分离得到。在一些实施方案中，所述单个核细胞的制备方法为外周血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500-800g离心20-30min。进一步地，本专利技术提供了一种抗肿瘤过继免疫细胞，所述抗肿瘤过继免疫细胞是通过上述制备方法得到。更进一步地，本专利技术提供了一种生物制品，所述生物制品含有通过上述制备方法得到的NKT细胞。有益效果本专利技术公开了一种新型的NKT细胞的培养方法，该方法培养的NKT细胞，细胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，可以获得更高纯度的NKT效应细胞，得到的NKT细胞杀伤效果也明显高于现有的培养方法。附图说明图1培养前流式结果图；图2培养14天后流式结果图；图3培养前细胞照片；图4培养14天后细胞培养的照片；图5 NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实验仪器、试剂和耗材如下：NKT细胞必须是在符合GMP条件的超净环境下制备。与细胞培养相关的材料必须是无菌、无致热原的，并严格按照操作说明书使用，有特殊说明的情况除外。实验所用仪器如表1所示，实验所用试剂如表2所示。表1实验用仪器名称货号/型号厂家生物安全柜BOOSERIES A2Thermo水平低速离心机X3Thermo二氧化碳培养箱FORMA SERIES II WATER JACKETThermo倒置显微镜XDS-113重庆广电血细胞记数器Z318427把因医疗血细胞计数板Z319023把因医疗移液器26300eppendorf热合机GZR-Ⅲ苏州市医用仪器-20℃冰箱BCD-322W博西华家用电气有限公司4℃冰箱BCD-322W博西华家用电气有限公司生化培养箱Blue pard上海一恒科学仪器有限公司表2实验用耗材实施例1：单个核细胞的分离在无偿献血者自愿的情况下，专利技术人采集人静脉外周血50mL，加入10mL生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液15mL的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500g-800g离心力，离心20-30min，提取中间白膜层细胞，即得单个核细胞，加生理盐水清洗两遍，计数，细胞量为2×107个～4×107个。实施例2细胞培养一、NKT原代细胞的制备1、将患者50-100mL外周血，均匀分至2管，用移液管吸取少许原血(约300μL)划线或滴入平皿进行检菌。然后，室温下，865g，离心15分钟(9,7，意指升9降7，下同)。2、将上层血浆转入离心管，56℃灭活30min，865g，10min离心，取上清备用。使用等体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀后，小心加到用50mL离心管分装的15mL Ficoll层上，使分层保持清晰。室温865g，离心20分钟(9，3)。3、吸取外周血单个核细胞(PBMC)层，尽量吸尽两液面交接处的细胞层，加5mL生理盐水吹打混匀，后加生理盐水稀释至45mL。700g，离心8分钟(9，7)。相同方法再次洗涤细胞。弃去上清后，用5mL无血清培养基重悬，定容20mL，吸取少量细胞计数。4、种瓶将20mL已混匀的细胞加入到225cm2培养瓶内，用10mL无血清培养基清洗离心管，并入培养瓶内，视细胞数量多少来添加培养基终体积为30-50mL，调整细胞密度为0.5-2×106个/mL。加入500-2000IU/mL的IFN-γ、患者血浆5-10mL，剩余血浆4℃密封保存备用。5、在标记培养瓶侧壁后，将其放入CO2培养箱内进行培养。查看并保持培养箱状态如下，温度：37±0.5℃、湿度：大于90％、CO2浓度：5％。6、将加好样品的血琼脂平板正置放入35℃恒温生化培养箱，记录放入日期及培养物品。隔夜后倒置，保留48小时。计算细胞密度及细胞数量细胞浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型的NKT细胞培养方法，该方法包括NKT原代细胞培养和NKT细胞继代培养，其特征在于，所述NKT原代细胞培养是采用外周血单个核细胞接种无血清培养基，所述继代培养的第一天向无血清培养基中加入启动因子人源化的CD3单抗、人源化的CD28单抗和IL‑2；随后在后续的扩增液中加入扩增因子IL‑2和IL‑7。
【技术特征摘要】
1.一种新型的NKT细胞培养方法，该方法包括NKT原代细胞培养和NKT细胞继代培养，其特征在于，所述NKT原代细胞培养是采用外周血单个核细胞接种无血清培养基，所述继代培养的第一天向无血清培养基中加入启动因子人源化的CD3单抗、人源化的CD28单抗和IL-2；随后在后续的扩增液中加入扩增因子IL-2和IL-7。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞接种无血清培养基的接种量为0.5-2×106个/mL。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化的CD3单抗的终浓度为50-500ng/mL，人源化的CD28单抗的终浓度为50-500ng/mL和IL-2的终浓度为2000-5000IU/mL。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人源化的CD3单抗的最优终浓度为500ng/mL，人源化的CD28单抗的最优终浓度为500ng/mL和IL-2的最优终浓度为5000IU\...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐榕，王立燕，
申请(专利权)人：北京同立海源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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