黑色素瘤抗原特异性CTL及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种黑色素瘤抗原特异性CTL及其制备方法，其中，所述黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法包括：获取外周血单核细胞；制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞；从所述外周血单核细胞中获取CD8+T淋巴细胞；用所述负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞刺激所述CD8+T淋巴细胞；采用Tetramer技术标记刺激后的所述CD8+T淋巴细胞，并分离出Tetramer+CD8+T淋巴细胞；刺激所述Tetramer+CD8+T淋巴细胞，而制得黑色素瘤抗原特异性CTL。本发明专利技术黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法的制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高达98％，且杀伤黑色素瘤细胞的效果好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫细胞
，尤其涉及一种黑色素瘤抗原特异性CTL及其制备方法。
技术介绍
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)是通过免疫治疗技术获得的细胞，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。CTL的作用机理如下：机体存在庞大的T淋巴细胞库，通过其表面表达不同的T淋巴细胞受体(TCR)特异识别不同的外部抗原分子(细菌、病毒和肿瘤抗原多肽)，被活化为具有灭杀靶细胞的CTL，清除细菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复发。CTL免疫应答大致分为四个阶段：1、抗原识别：APC(专职抗原递呈细胞，如DC细胞)通过表面受体识别并捕获抗原(细菌、病毒、肿瘤抗原多肽)；2、抗原加工与递呈：抗原经APC消化、裂解成多肽分子，后者与APC胞内丰富的MHC-I类或II类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表面；3、T淋巴细胞激活(双信号学说)：APC与T淋巴细胞相遇，T淋巴细胞通过自身TCR识别APC递呈的MHC-I/II-多肽复合物，其中CD8+T淋巴细胞识别MHC-I-多肽复合物，CD4+T淋巴细胞识别MHC-II-多肽复合物，T淋巴细胞接受了抗原的刺激信号(第一信号)加上免疫共刺激信号(第二信号)开始活化，具有细胞毒性作用，即CTL；4、靶细胞杀灭：活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原表达细胞后进行杀伤和清除。但是，已发现肿瘤患者体内存在大量免疫抑制因子，影响CTL的有效活化和增殖，数量甚少，不足以与迅速增殖的肿瘤抗衡。若能在体外制备大量抗原特异性CTL并回输给患者，可直接、快速杀伤肿瘤细胞起到治疗作用，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀灭，将可以防止肿瘤的复发和转移。然而，现有技术中并未提供体外制备的黑色素瘤抗原特异性CTL，进而无法通过回输患者而直接、快速杀伤人类黑色素瘤细胞。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，旨在获得黑色素瘤抗原特异性CTL，而直接、快速杀伤人类黑色素瘤细胞。为实现上述目的，本专利技术提供一种黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，包括步骤如下：获取外周血单核细胞；制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞；从所述外周血单核细胞中获取CD8+T淋巴细胞；用所述负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞刺激所述CD8+T淋巴细胞；采用Tetramer技术标记刺激后的所述CD8+T淋巴细胞，并分离出Tetramer+CD8+T淋巴细胞；刺激所述Tetramer+CD8+T淋巴细胞，而制得黑色素瘤抗原特异性CTL。优选地，所述制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞的过程中，包括步骤如下：合成黑色素瘤抗原多肽；从所述外周血单核细胞中获得未成熟DC细胞；将所述未成熟DC细胞诱导为成熟DC细胞；共培养所述成熟DC细胞与所述黑色素瘤抗原多肽，而制得负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞。优选地，所述将所述未成熟DC细胞诱导为成熟DC细胞的过程中，包括步骤如下：向所述未成熟DC细胞中加入含人AB血清、GM-CSF、IL-4和TGF-β1的RPMI-1640完全培养基；4～10天后，加入含GM-CSF、IL-4、TNF、IL-6、IL-1β和PGE2的新鲜培养基；24～72h后，加入含人β2-微球蛋白的无血清完全培养基，刺激1～4h后，获得成熟DC细胞。优选地，所述RPMI-1640完全培养基中，人AB血清的体积百分比为5～20％，GM-CSF的浓度为500～1000U/ml，IL-4的浓度为200～800U/ml和TGF-β1的浓度为2～10ng/ml；所述新鲜培养基中，GM-CSF的浓度为500～1000U/ml，IL-4的浓度为200～800U/ml，TNF的浓度为5～20ng/ml，IL-6的浓度为500～2000U/ml，IL-1β的浓度为5～20ng/ml，PGE2的浓度为0.5～5μg/ml；所述无血清完全培养基中，人β2-微球蛋白的浓度为2～20μg/ml。优选地，所述未成熟DC细胞与从所述外周血单核细胞中获取的CD8+T淋巴细胞的数量比为1:(6～10)。优选地，所述刺激所述Tetramer+CD8+T淋巴细胞过程中，包括步骤如下：辐照处理部分所述外周血单核细胞、和人EB病毒转化的B淋巴细胞；将淋巴细胞活化刺激剂、和辐照后的所述外周血单核细胞、人EB病毒转化的B淋巴细胞刺激所述Tetramer+CD8+T淋巴细胞。优选地，所述黑色素瘤抗原多肽为HLA-A2限制性黑色素瘤抗原多肽。优选地，所述黑色素瘤抗原多肽为HLA-A2限制性Melan-A抗原多肽。优选地，所述黑色素瘤抗原多肽为HLA-A2限制性gp100抗原多肽。此外，为实现上述目的，本专利技术还提供一种如上所述的黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法所获得的黑色素瘤抗原特异性CTL。本专利技术黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高达98％且杀伤人黑色素瘤细胞的杀伤效果好，在目标CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10：1时，高达到39％。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供一种黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，包括步骤如下：S1、获取外周血单核细胞；S2、制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞；S3、从外周血单核细胞中获取CD8+T淋巴细胞；S4、用负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞刺激CD8+T淋巴细胞；S5、采用Tetramer技术标记刺激后的CD8+T淋巴细胞，并分离出Tetramer+CD8+T淋巴细胞；S6、刺激Tetramer+CD8+T淋巴细胞，而制得黑色素瘤抗原特异性CTL。本专利技术黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法通过负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞刺激CTL前体细胞(CD8+T淋巴细胞)，不仅供给T淋巴细胞活化的第一信号(黑色素瘤抗原)，而且DC细胞供给T淋巴细胞活化必须的第二信号(免疫共刺激分子CD40、CD80、CD83等)；然后，分离出Tetramer+CD8+T淋巴细胞，而剔除非特异性扩增的T细胞，以减少其对目标CTL增殖的影响；最后，经刺激增殖获得目标CTL；该制备方法制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高达98％且杀伤人黑色素瘤细胞的杀伤效果好，在目标CTL对靶细胞的特异性杀伤活性在效靶比为10：1时，高达到39％。需要说明的是，该外周血单核细胞通过自动单核细胞采集仪从采集的患者(已签署知情同意书)的外周血中分离得到，获得的外周血单核细胞至少分为三部分：部分用于制备DC细胞，部分用于分离出CTL前体细胞，部分用于辐照处理。该黑色素瘤抗原多肽可以为多种，由于均可被T淋巴细胞所识别，进而均可以刺激T淋巴细胞产生第一信号，同时也均可被DC细胞所抗原递呈而实现抗原多肽的负载，因此，该黑色素瘤抗原多肽可以选自下表1中的任意一种黑色素瘤抗原：表1、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：获取外周血单核细胞；制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞；从所述外周血单核细胞中获取CD8+T淋巴细胞；用所述负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞刺激所述CD8+T淋巴细胞；采用Tetramer技术标记刺激后的所述CD8+T淋巴细胞，并分离出Tetramer+CD8+T淋巴细胞；刺激所述Tetramer+CD8+T淋巴细胞，而制得黑色素瘤抗原特异性CTL。

【技术特征摘要】
1.一种黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：获取外周血单核细胞；制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞；从所述外周血单核细胞中获取CD8+T淋巴细胞；用所述负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞刺激所述CD8+T淋巴细胞；采用Tetramer技术标记刺激后的所述CD8+T淋巴细胞，并分离出Tetramer+CD8+T淋巴细胞；刺激所述Tetramer+CD8+T淋巴细胞，而制得黑色素瘤抗原特异性CTL。2.如权利要求1所述的黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述制备负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞的过程中，包括步骤如下：合成黑色素瘤抗原多肽；从所述外周血单核细胞中获得未成熟DC细胞；将所述未成熟DC细胞诱导为成熟DC细胞；共培养所述成熟DC细胞与所述黑色素瘤抗原多肽，而制得负载黑色素瘤抗原多肽的成熟DC细胞。3.如权利要求2所述的黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述将所述未成熟DC细胞诱导为成熟DC细胞的过程中，包括步骤如下：向所述未成熟DC细胞中加入含人AB血清、GM-CSF、IL-4和TGF-β1的RPMI-1640完全培养基；4～10天后，加入含GM-CSF、IL-4、TNF、IL-6、IL-1β和PGE2的新鲜培养基；24～72h后，加入含人β2-微球蛋白的无血清完全培养基，刺激1～4h后，获得成熟DC细胞。4.如权利要求3所述的黑色素瘤抗原特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述RPMI-1640完全培养基中，人AB血清的体积百分比为5～20％，GM-CSF的浓度为500～1000U/ml，IL-4的浓度为200...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44