癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种使用在细菌中进行同源重组取代在细胞中进行同源重组的方法步骤，以获得溶瘤病毒携带抗癌基因的质粒和病毒(即癌症的靶向基因‑病毒治疗，Cancer Targeting Gene‑Viro‑Therapy，CTGVT)。CTGVT乃将抗癌基因加入到溶瘤病毒(Oncolytic Virus,OV)构建而成，故亦即OV‑gene治疗。采用本发明专利技术方法构建一个CTGVT(OV‑gene)一般不到1个月即可完成，效率高，准确率高，解决了科学工作者的一个难题，使溶瘤病毒的构建工作进度可大大地加快而准确地完成。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及溶瘤腺病毒领域，具体地说，是关于一种癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法。
技术介绍
重组包括不同方法：1、利用限制性切酶将不同DNA切开，再用连接酶把不同DNA片段联接起来，称为DNA重组；2.、利用DNA片段两端DNA含有相同(或叫同源)DNA序列，进行同源重组，即利用DNA片段两端的DNA片段的顺序相同，将一个DNA片段替换到另一个DNA片段。在当今癌症治疗领域中，由刘新垣院士创建了OV-gene治疗策略，即癌症的靶向基因-病毒治疗策略(Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy，CTGVT)，也就是说将抗癌基因加入到溶瘤病毒载体(Oncolytic Virus，OV)中。将癌症的溶瘤病毒治疗与癌症的基因治疗相结合的方法是治疗癌症的一个革命性的学说，可以达到全歼移植性肿瘤的作用，其中重点在于将非复制型病毒载体(Ad)更换成可复制型的溶瘤病毒载体(Oncolytic Virus，OV)。Ad无靶向性，无复制能力，故抗癌作用很弱，而OV能在癌细胞中复制数万倍，它所携带的抗癌基因也随之复制数万倍，故抗癌能力大增，其结果是OV-gene的抗癌效果远远超过OV或Ad-gene。用OV载体取代Ad载体，在癌症治疗中是非常重要的革命性改进。然而，过去构建一个癌症靶向基因-溶瘤病毒需在细胞中进行同源重组，要花时数月，且错误很多，野生型多，需空斑纯化，时间最长可达半年，甚至到最后还纯化不到所需溶瘤病毒，以失败告终，大大妨碍科学工作。腺病毒在正常细胞和癌细胞中都能复制，不能针对癌细胞进行选择性复制。通过对腺病毒进行更换启动子、突变等修饰操作，获得溶瘤腺病毒，其
能够特异性地在癌细胞中复制，而不对正常细胞产生影响。溶瘤腺病毒构建过程中最困难的一步，是包含有人工修饰的腺病毒片段的穿梭的小质粒与腺病毒大质粒进行同源重组的步骤，传统的这一步骤在细胞中进行，其效率低，花费时间长。由Quantum Biotechnology基因公司创造了AdEasyTM方法，将这一同源重组的构建过程从细胞改到细菌(大肠杆菌BJ5183)中进行，因后者含重组酶很高，故效率高，成功率高，但AdEasy只能用于构建复制缺陷型腺病毒的同源重组用于基因治疗(Ad-gene)，目前仍未有高效的、能够应用于可复制的溶瘤腺病毒的同源重组的系统的相关报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种使用在细菌中进行同源重组取代在细胞中进行同源重组的方法，以获得溶瘤病毒携带抗癌基因的质粒和病毒(即癌症的靶向基因-病毒治疗，Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy，CTGVT)。CTGVT乃将抗癌基因加入到溶瘤病毒(Oncolytic Virus,OV)构建而成，故亦即OV-gene治疗。所述方法包括四个步骤。具体地说，第一步构建穿梭质粒(pSW-X)，第二步利用在细菌中进行同源重组，在AdEasy-1上加入E3区，构建大质粒pBHG581，第三步将pSW-X与大质粒pBGH581在BJ5183细菌中进行同源重组，获得pCTGVT(pOV-gene)，然后进一步用PacI线性化，在HEK293细胞中包装，获得所需溶瘤腺病毒。因此本专利技术的第一个目的在于提供一种癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法。本专利技术的第二个目的在于提供根据上述构建方法制备获得各种不同改进的癌症靶向基因-溶瘤腺病毒。为了达到上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：根据本专利技术的第一个方面，一种癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法，所述方法包括在细菌中进行同源重组取代在细胞中进行同源重组，以获得溶瘤腺病毒携带抗癌基因的质粒和病毒。根据本专利技术，所述方法包括以下步骤：(A)穿梭质粒pSW-X的构建：在pXC2中，将五型腺病毒基因组上的正常E1A或E1B改为能提高五型腺病毒癌症靶向性的mE1A或mE1B(m代表mustated E1A或E1B，包括在改造E1A或E1B或更换其启动子或在其中加基因)，用XhoI和MfeI酶切，然后与XhoI和MfeI切开的pShuttle相结合，构建获得pSW-X；(B)腺病毒大质粒pBGH581的构建：将含腺病毒E3区的pBHGE3用HindIII酶切，然后与经SpeI或SrfI线性化的pAdEasy-1共转化到大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得腺病毒大质粒pBHG581；(C)pOV-gene的构建：将步骤(A)中所述pSW-X用PmeI线性化后，与步骤(B)中所述pBHG581共转化到大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得pOV-gene。(D)将步骤(C)中所述pOV-gene经PacI线性化，转染到HEK293细胞中包装，获得癌症靶向基因-溶瘤腺病毒。根据本专利技术的第二个方面，根据上述构建方法制备获得的溶瘤腺病毒携带抗癌基因的质粒和病毒。有益效果：本专利技术主要是不同产品的构建方法，即构建带有抗癌基因、有靶向性又能复制的CTGVT或OV-gene，其中抗癌基因是现有的，主要就是要构建有靶向性、能复制的CTGVT(OV-gene)，关键点是将过去的在HEK293细胞同源重组改为在BJ5183细菌中进行同源重组，过去在细胞中进行同源重组，效率低，错误率高，完成一个OV-gene的构建需要几个月，而细菌BJ5183含很高的重组酶，故重组效率高，含野生型腺病毒少或无(野生型Ad必需除去)，采用本专利技术方法构建一个CTGVT(OV-gene)一般不到1个月即可完成，效率高，准确率高，解决了科学工作者的一个难题，使溶瘤病毒的构建工作进度可大大地加快而准确地完成。附图说明图1为本专利技术的实施例1的pSW-X质粒的构建示意图。图2为本专利技术的实施例1的pBHG581通用型质粒的构建示意图。图3为本专利技术的实施例1的OV-gene的构建示意图。图4为本专利技术实施例2的构建示意图。图5为本专利技术实施例3的构建示意图。图6为本专利技术实施例3的构建示意图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。实施例1、本专利技术的癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法的原理说明如下：步骤一、pSW-X穿梭质粒的构建如图1所示，在pXC2(市售)中，根据已知的现有技术，将五型腺病毒基因组上的正常E1A或E1B改为能提高五型腺病毒癌症靶向性的mE1A或mE1B(m代表mustated E1A或E1B，即改造的E1A或E1B或替换其启动子，也包括在mE1A或mE1B中加上基因)，用XhoI和MfeI酶切，然后与XhoI和MfeI切开的pShuttle(购自Agilent Technologies公司，6586bp)相结合，构建获得pSW-X(约9512bp)。步骤二、pBHG58通用型腺病毒大质粒的构建如图2所示，将含腺病毒E3区的pBHGE3(37436bp)用HindIII酶切，然后与经SpeI或SrfI线性化的pAdEasy-1(购自Agilent Technologies公司，33442bp，只含小部分E3区)共转到大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得可通用的腺病毒大质粒pBHG581(即在pAdEasy中加入E3，即pAdEasy-E3)。在pBHGE3中含有很多HindⅢ，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种癌症靶向基因‑溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，所述方法包括在细菌中进行同源重组取代在细胞中进行同源重组，以获得溶瘤腺病毒携带抗癌基因的质粒和病毒。

【技术特征摘要】
1.一种癌症靶向基因-溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，所述方法包括在细菌中进行同源重组取代在细胞中进行同源重组，以获得溶瘤腺病毒携带抗癌基因的质粒和病毒。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(A)穿梭质粒pSW-X的构建：在pXC2中，将五型腺病毒基因组上的正常E1A或E1B改为能提高五型腺病毒癌症靶向性的mE1A或mE1B同时还带有基因，用XhoI和MfeI酶切，然后与XhoI和MfeI切开的pShuttle质粒相结合，构建pSW-X；(B)腺病毒大质粒pBGH581的构建：将含腺病毒E3区的pBH...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘新垣，吴帅，尹晓飞，褚亮，杨玙，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31