本发明专利技术公开了一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法，属于高通量筛选技术领域。本发明专利技术通过进行PI金色链霉菌孢子染色法，利用流式细胞术对金色链霉菌孢子的活性检测，实现了对金色链霉菌孢子的活性区分以及孢子的绝对计数。对分析出的活孢子群进行进一步的分选培养，为金色链霉菌的高通量筛选提供一种方式。对分选后的活孢子采用固液结合的高通量培养方案，有效提高了金色链霉菌孔板生长率。显色反应和多孔板检测方法作为一种方便快速的检测手段，可对大量样本同时检测。本发明专利技术基于流式细胞仪分选有活性的金色链霉菌，为高通量筛选金霉素高产菌株提供一种新型有效的方式。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法，属于高通量筛选
技术介绍
金霉素(Chorotetracycline，即CTC)属于四环素类的一种广谱抗生素。金霉素能够抑菌、促生长、饲料利用率高、在肌体内残留量低。其生产技术已经较为成熟，生产成本也较低，成为目前饲料工业中用量最大的抑菌促生长剂。目前国内工厂金霉素的产率还较低(效价在18000μg/mL左右)，因此提高金霉素的产率很有必要。金霉素是由金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)发酵得到的次级代谢产物，其产量合成性状受多基因决定，代谢网络复杂。影响金霉素发酵过程的因素也很多，如种子的质量、培养基的组成、工艺条件以及发酵过程的代谢控制等。目前微生物育种技术已经从诱变、推理、重组技术发展到代谢工程、系统生物学和异源生物合成等方法。但传统诱变育种仍具有诸多优势。如不需要知道生物遗传背景、代谢模型，只需要获得有效突变库和定向筛选。高通量筛选与常规诱变结合，适用于以提高次级代谢产物产量为目标的工业生产菌株选育，尽可能减少漏筛现象。目前的经典诱变结合高通量筛选方法，由于经典诱变会存在大量死细胞而可能导致后续可培养无法实现，同时经典诱变后的菌株要进一步分离纯化、扩大培养之后才能进行后续酶标板等高通量筛选而存在筛选周期长等问题。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术联合经典诱变、流式细胞术、高通量孔板筛选、固液联合培养，提供了一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法。本专利技术基于流式细胞术对金霉素高通量筛选，可在短时间内对大量有效菌株进行分析，从而分选目的活孢子，进而进行高通量培养检测。本专利技术的基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法，主要包括步骤如下：(1)获得金色链霉菌的多个含量死孢子在内的待筛选的孢子；(2)利用PI染料对步骤(1)的待筛选的孢子进行染色；(3)使用流式细胞仪检测孢子活性；(4)利用流式细胞仪分选有活性孢子，直接将单个有活性的孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中；(5)待高通量孔板的固体培养基上培养2～3天，直接添加液体种子培养基继续培养得到种子液；将培养好的种子液转接入含有发酵培养基的新的高通量孔板中，发酵培养；(6)配置一定浓度梯度的金霉素标准品，吸取Tris-HCl缓冲溶液、Sm(NO)3溶液、各浓度标准品溶液，震荡混匀至显色完全，用酶标仪检测，得到金霉素与405nm下的吸光值OD的关系；发酵培养结束后，取发酵液上清，在合适的浓度下加入到含有Tris-HCl缓冲溶液和钐溶液的孔板中，震荡混匀至颜色变为淡黄色，然后用酶标仪测定405nm下的吸光值OD，进而得知待筛选菌株产金霉素含量的相对高低；(7)选取上一步得到的金霉素含量相对较高的菌株多株，进行复筛。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选孢子可以是不同活性的孢子，包括死孢子。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选孢子是将金色链霉菌进行诱变后得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选的孢子中，死孢子含量达90％以上，优选地达95％以上更优选地达99％以上。在本专利技术的一种实施方式中，所述诱变，可以是物理诱变或者化学诱变，比如常压室温等离子体(ARTP)诱变、紫外诱变、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、硫酸二乙酯(DES)诱变等等。。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)的染色，具体是：将待筛选的孢子调整至浓度105～106个孢子/mL的悬浮液，将等体积悬浮液与10μg/mL PI染色剂混合，避光放置4℃冰箱孵育20min。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)和步骤(4)具体是：以没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将完全无活性的与PI染色剂结合的样品设置为阳性对照，确定阴性与阳性孢子群体；取染色后的金色链霉菌孢子悬浮液，重新过滤，稀释一定倍数，上流式细胞仪分析，用FL3通道((610±15)nm)检测，将无荧光区域最集中部分设门分选至装有固体培养基的高通量孔板中，每孔分选设定为单个孢子。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(4)中，装有固体培养基的高通量孔板中固体培养基的体积为50μL/孔。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中，是培养至长出可见孢子后添加液体种子培养基。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中液体种子培养基的添加量为150μL/孔。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中发酵培养液的添加量为900μL/孔。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(6)，在线性浓度范围内，目标物浓度越大，OD值越大。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(6)的一定浓度梯度是0～360μg/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(6)，是绘制金霉素与405nm下的吸光值OD的标准曲线；发酵培养结束后，发酵上清液稀释至合适浓度，加入到提前添加了Tris-HCl缓冲溶液和钐溶液的孔板中，震荡混匀至颜色变为淡黄色，然后用酶标仪测定405nm下的吸光值OD，将吸光值OD代入标准曲线，得到相应的金霉素含量。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(6)，是将20μL Tris-HCl缓冲溶液、60μL Sm(NO)3溶液、120μL各浓度标准品金霉素溶液或者稀释后的发酵液震荡混匀。在本专利技术的一种实施方式中，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为6.7，Sm(NO)3溶液的浓度为5×10-4mol/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述高通量孔板可以是96深孔板、96浅孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等任意一种具有高通量筛选作用的培养器皿。优选地，装有固体培养基的高通量孔板为96浅孔板，装有发酵培养基的高通量孔板为48深孔板。本专利技术的有益效果：本专利技术方法结合了常压室温等离子体(ARTP)、PI染色法、流式细胞术分析分选法、酶标仪检测、固液结合的培养方法和高通量筛选技术，对分选有活性金色链霉菌孢子培养提供了一种精确快速的方法。本专利技术方法基于流式细胞仪能够在短时间内对单孢子检测，从而建立庞大的分析目标群体，流式细胞术高通量的分选培养减少了在平板上生长的过程，不漏筛每个孢子，分选速度和筛选效率得以提高。此外，利用固液结合的培养方法直接提高了单个金色链霉菌孢子的生长率，解决了单个孢子在液体培养基中生长困难的问题。具体实施方式培养基：(1)固体培养基(g/L)：蔗糖20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。(2)种子培养基(g/L)：蔗糖30g，进口酵母粉5g，MgSO40.5g，(NH4)2SO43g，NaCl4g，KH2PO41g，CaCO30.2g。(3)孔板发酵培养基(g/L)：蔗糖30g，MgSO40.5g，CaCO30.33g，柠檬酸2.55g，(NH4)2SO43g，1mL混合液(0.3％CuSO4·5H2O、0.5％ZnSO4·7H2O、0.25％MnSO4`4H2O)。荧光染料配制：称取0.01g PI，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液定容至10mL。梯度稀释至10μg/mL。4℃避光保存。PI染料对金色链霉菌孢子染色：取等体积金色链霉菌孢子悬液和10μg/mLPI染料混合，避光放置4℃冰箱染色20min。流式细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法，其特征在于，主要包括步骤如下：(1)获得金色链霉菌的多个含量死孢子在内的待筛选的孢子；(2)利用PI染料对步骤(1)的待筛选的孢子进行染色；(3)使用流式细胞仪检测孢子活性；(4)利用流式细胞仪分选有活性孢子，直接将单个有活性的孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中；(5)待高通量孔板的固体培养基上培养2～3天，直接添加液体种子培养基继续培养得到种子液；将培养好的种子液转接入含有发酵培养基的新的高通量孔板中，发酵培养；(6)配置一定浓度梯度的金霉素标准品，吸取Tris‑HCl缓冲溶液、Sm(NO)3溶液、各浓度标准品溶液，震荡混匀至显色完全，用酶标仪检测，得到金霉素与405nm下的吸光值OD的关系；发酵培养结束后，取发酵液上清，在合适的浓度下加入到含有Tris‑HCl缓冲溶液和钐溶液的孔板中，震荡混匀至颜色变为淡黄色，然后用酶标仪测定405nm下的吸光值OD，进而得知待筛选菌株产金霉素含量的相对高低；(7)选取上一步得到的金霉素含量相对较高的菌株多株，进行复筛。
【技术特征摘要】
1.一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法，其特征在于，主要包括步骤如下：(1)获得金色链霉菌的多个含量死孢子在内的待筛选的孢子；(2)利用PI染料对步骤(1)的待筛选的孢子进行染色；(3)使用流式细胞仪检测孢子活性；(4)利用流式细胞仪分选有活性孢子，直接将单个有活性的孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中；(5)待高通量孔板的固体培养基上培养2～3天，直接添加液体种子培养基继续培养得到种子液；将培养好的种子液转接入含有发酵培养基的新的高通量孔板中，发酵培养；(6)配置一定浓度梯度的金霉素标准品，吸取Tris-HCl缓冲溶液、Sm(NO)3溶液、各浓度标准品溶液，震荡混匀至显色完全，用酶标仪检测，得到金霉素与405nm下的吸光值OD的关系；发酵培养结束后，取发酵液上清，在合适的浓度下加入到含有Tris-HCl缓冲溶液和钐溶液的孔板中，震荡混匀至颜色变为淡黄色，然后用酶标仪测定405nm下的吸光值OD，进而得知待筛选菌株产金霉素含量的相对高低；(7)选取上一步得到的金霉素含量相对较高的菌株多株，进行复筛。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的待筛选孢子是不同活性的孢子，包括死孢子。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的待筛选孢...
【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，王得明，陈玥，张庆辉，曹晓梅，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。