黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法技术

黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法，将离体卵巢浸泡在培养液中，置于37℃，5% CO2条件恒温培养箱内培养，接着移至含渗透性低温保护剂乙二醇预平衡液中浸泡，然后移至含高浓度低温保护剂的玻璃化冻存液中继续渗透平衡，最后移至液氮中至少24小时；解冻过程为，将冻存的卵巢从液氮中取出，依此放置于37℃预热的蔗糖浓度递减的0.50mol/L、0.25 mol/L及0.125 mol/L的解冻液中各10分钟，再移至培养液中，置于37℃，5% CO2条件恒温培养箱内培养；培养液、预平衡液、玻璃化冻存液、解冻液均含有黄体生成素,可以提高冻存后卵巢的存活率，较大程度的保留其生殖功能与内分泌功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及玻璃化冻存技术，尤其涉及一种黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法。
技术介绍
离体的卵巢组织的体外培养及冻存可为由卵巢组织获得雌性生殖干细胞及各级卵泡提供便利条件,使这些技术的开展不受时间及地点的限制。同时，离体的卵巢组织便于研究卵细胞的发育机制，结合体外受精或者孤雌激活技术获取大量胚胎干细胞用于科研，还助于建立卵子库，为女性提供生殖保险。当前离体卵巢组织主要是离体后直接培养，然后研究使用，但是由于野外条件限制或者培养条件不佳，不能为离体卵巢组织提供最佳的保存环境时，离体卵巢组织细胞就会凋亡，导致很多珍贵的离体卵巢组织材料不能得到很好的保存，就眼睁睁的看着珍稀的卵巢组织离体材料无可挽回的消失殆尽，如果能采取冻存方式保留离体卵巢组织，然后在合适条件下解冻，是保存、转移一些珍贵卵巢组织的最佳方法。离体卵巢组织经过合适的方法冻存后，是可以保留卵巢生殖功能与内分泌功能的，但是，当前卵巢冻存解冻技术存在一个问题难题是，目前还没有一种廉价、稳定和安全的冻存解冻方法。卵巢中存在处于不同发育阶段的各级卵泡，包括原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡和窦卵泡，直接将卵巢组织冻存，然后解冻，并在体外培养，只有少数卵泡发育到排卵前卵泡，其他大部分卵泡会停止发育，形成闭锁卵泡，这导致卵巢中的大部分卵泡在冻存过程中死亡，保留冻存卵巢生殖功能与内分泌功能的效果。现在有使用褪黑素、血管内皮生长因子，促红细胞生成素等药物对卵巢进行干预的冻存方法，以提高冻存后卵巢内卵泡的存活率，但多数是联合使用，成本高昂。因此，需要更为简洁而有效的干预方法来确保冻存卵巢内存活卵泡的数量。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种天然的卵巢靶向保护性物质--黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法，黄体生成素（luteinizing hormone，LH）是一个调控卵泡发育的重要激素，在卵巢激素的合成和排卵过程中发挥重要的作用，在卵巢冻存解冻的过程中，使用LH进行干预，可以提高冻存后卵巢的存活率，较大程度的保留其生殖功能与内分泌功能。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法，包括以下步骤：离体卵巢预培养：将离体卵巢浸泡在培养液中，置于37℃，5% CO2条件下的恒温培养箱内培养，得到预培养后的离体卵巢；所述培养液包括黄体生成素；离体卵巢预渗透平衡：室温下，将预培养后的离体卵巢转移至含渗透性低温保护剂的预渗透平衡液中渗透，得到预渗透平衡后的离体卵巢；所述预渗透平衡液包括包括黄体生成素；离体卵巢渗透平衡：将预渗透平衡后的离体卵巢室温下转移至含高浓度低温保护剂的玻璃化冻存液中继续渗透平衡，得到冻存液渗透平衡后的离体卵巢；所述玻璃化冻存液包括黄体生成素；离体卵巢冻存：将冻存液渗透平衡后的离体卵巢转移至液氮中放置至少24小时。最优的，所述黄体生成素浓度为0.15 IU/ml、0.30 IU/ml或者0.60 IU/ml。最优的，所述离体卵巢是1mm×1mm×2mm大小；所述离体卵巢预培养步骤中，置于37℃，5% CO2条件下的恒温培养箱内培养时间为60分钟、120分钟或240分钟。最优的，所述离体卵巢预渗透平衡步骤中，离体卵巢在含渗透性低温保护剂的预渗透平衡液中渗透时间为8分钟；所述离体卵巢渗透平衡步骤中，离体卵巢在含高浓度低温保护剂的玻璃化冻存液中继续渗透平衡时间为3.5分钟。最优的，所述培养液是按照12%牛血清白蛋白5ml与基础液45ml的比例混合，再添加黄体生成素而成；所述预渗透平衡液是按照12%牛血清白蛋白10ml、渗透性低温保护剂乙二醇8.36ml与基础液31.64ml的比例混合，再添加黄体生成素而成；所述玻璃化冻存液是按照渗透性低温保护剂乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、非渗透性保护剂蔗糖8.56 g与基础液24.7ml的比例混合，再添加黄体生成素而成；所述基础液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸链霉素0.1 g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亚砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接着使用5.6% NaHCO3 溶液调整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。黄体生成素干预下的成年小鼠卵巢玻璃化解冻方法，包括以下步骤：冻存卵巢再次解冻：将初次解冻的卵巢转移至37℃预热的含0.25 mol/L蔗糖的解冻液中，得到再次解冻的卵巢；所述解冻液中包括黄体生成素；冻存卵巢的解冻：将再次解冻的卵巢转移至37℃预热的含0.125 mol/L蔗糖的解冻液中，得到解冻的卵巢；所述解冻液中包括黄体生成素；冻存保护剂的洗脱：将解冻的卵巢转移至培养液中洗脱去蔗糖，得到洗脱后的卵巢；所述培养液包括黄体生成素；解冻卵巢的后培养：将洗脱后的卵巢转移至培养液中，置于37℃，5% CO2条件下的恒温培养箱内培养，得到解冻后培养的卵巢；所述培养液包括黄体生成素。最优的，所述黄体生成素浓度为0.15 IU/ml、0.30 IU/ml或者0.60 IU/ml。最优的，所述离体卵巢是1mm×1mm×2mm大小；所述冻存卵巢初次解冻步骤中，放置于37℃预热的含0.5 mol/L蔗糖的解冻液中10分钟；所述冻存卵巢再次解冻步骤中，放置于37℃预热的含0.25 mol/L蔗糖的解冻液中10分钟；所述冻存卵巢的解冻步骤中，放置于37℃预热的含0.125 mol/L蔗糖的解冻液中10分钟；所述冻存保护剂的洗脱步骤中，在培养液中洗脱10分钟以洗脱去蔗糖。最优的，所述解冻卵巢的后培养步骤中，置于37℃，5% CO2条件下的恒温培养箱内培养时间为120分钟、240分钟或者480分钟。最优的，所述含0.5 mol/L蔗糖的解冻液是按照蔗糖8.56 g、12%牛血清白蛋白10 ml与基础液40ml的比例混合，再添加黄体生成素而成；所述含0.25 mol/L蔗糖的解冻液是将含0.5 mol/L蔗糖的解冻液加等体积的基础液稀释而成，再添加黄体生成素而成；所述含0.125 mol/L蔗糖的解冻液是将含0.5 mol/L蔗糖的解冻液加两倍体积的基础液稀释而成，再添加黄体生成素而成；所述培养液是按照12%牛血清白蛋白5ml与基础液45ml的比例混合，再添加黄体生成素而成；所述基础液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸链霉素0.1 g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亚砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接着使用5.6% NaHCO3 溶液调整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种天然的卵巢靶向保护性物质--黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法和黄体生成素干预下的成年小鼠卵巢玻璃化解冻方法；黄体生成素是卵巢调控卵泡发育的重要激素，属于内源性激素，有效期长且靶向有针对性，黄体生成素干预后的卵巢经过玻璃化冻存、解冻后有显著高于对照的卵泡存活率，使经过冻存解冻过程后的卵巢显示更佳的生殖功能与内分泌功能，对于冻存卵巢技术有很大的意义。附图说明附图1是LH干预对小鼠卵巢Survivin表达影响的免疫组织化学结果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：离体卵巢预培养：将离体卵巢浸泡在培养液中，置于37℃，5% CO2条件下的恒温培养箱内培养，得到预培养后的离体卵巢；所述培养液包括黄体生成素；离体卵巢预渗透平衡：室温下，将预培养后的离体卵巢转移至含渗透性低温保护剂的预渗透平衡液中渗透，得到预渗透平衡后的离体卵巢；所述预渗透平衡液包括包括黄体生成素；离体卵巢渗透平衡：将预渗透平衡后的离体卵巢室温下转移至含高浓度低温保护剂的玻璃化冻存液中继续渗透平衡，得到冻存液渗透平衡后的离体卵巢；所述玻璃化冻存液包括黄体生成素；离体卵巢冻存：将冻存液渗透平衡后的离体卵巢转移至液氮中放置至少24小时。

【技术特征摘要】
1.一种黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：离体卵巢预培养：将离体卵巢浸泡在培养液中，置于37℃，5% CO2条件下的恒温培养箱内培养，得到预培养后的离体卵巢；所述培养液包括黄体生成素；离体卵巢预渗透平衡：室温下，将预培养后的离体卵巢转移至含渗透性低温保护剂的预渗透平衡液中渗透，得到预渗透平衡后的离体卵巢；所述预渗透平衡液包括包括黄体生成素；离体卵巢渗透平衡：将预渗透平衡后的离体卵巢室温下转移至含高浓度低温保护剂的玻璃化冻存液中继续渗透平衡，得到冻存液渗透平衡后的离体卵巢；所述玻璃化冻存液包括黄体生成素；离体卵巢冻存：将冻存液渗透平衡后的离体卵巢转移至液氮中放置至少24小时。2.根据权利要求1所述的黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法，其特征在于：所述黄体生成素浓度为0.15 IU/ml、0.30 IU/ml或者0.60 IU/ml。3.根据权利要求2所述的黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法，其特征在于：所述离体卵巢是1mm×1mm×2mm大小；所述离体卵巢预培养步骤中，置于37℃，5% CO2条件下的恒温培养箱内培养时间为60分钟、120分钟或240分钟。4.根据权利要求3所述的黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法，其特征在于：所述离体卵巢预渗透平衡步骤中，离体卵巢在含渗透性低温保护剂的预渗透平衡液中渗透时间为8分钟；所述离体卵巢渗透平衡步骤中，离体卵巢在含高浓度低温保护剂的玻璃化冻存液中继续渗透平衡时间为3.5分钟。5.根据权利要求1～4中任意一项所述的黄体生成素干预下的卵巢玻璃化冻存方法，其特征在于：所述培养液是按照12%牛血清白蛋白5ml与基础液45ml的比例混合，再添加黄体生成素而成；所述预渗透平衡液是按照12%牛血清白蛋白10ml、渗透性低温保护剂乙二醇8.36ml与基础液31.64ml的比例混合，再添加黄体生成素而成；所述玻璃化冻存液是按照渗透性低温保护剂乙二醇15.3ml、添加有15 g聚蔗糖的12%牛血清白蛋白10ml、非渗透性保护剂蔗糖8.56 g与基础液24.7ml的比例混合，再添加黄体生成素而成；所述基础液是按照DMEM粉5 g、F12 5.3g、硫酸链霉素0.1 g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38 g、 NaHCO3 2.38 g、二甲基亚砜10 ml、青霉素150 IU的比例混合，接着使用5.6% NaHCO3 溶液调整PH值到7.1～7.4，最后加1000ml三蒸水而成。6.黄体生成素干预下的卵巢玻璃化解冻方法，其特征在于，包括以下步骤：冻存卵巢初次解冻：将冻存的卵巢从液氮中取出，放置于37℃预热的含0.5 mol/L蔗糖的解冻液中，得到初次...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕蓉，裴秀英，常青，陈杰，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64