一种免疫调节蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术运用基因工程手段提供了一种新的免疫调节蛋白。本发明专利技术还提供并合成了编码上述蛋白的基因。经实验证实，本发明专利技术的蛋白与已发现的多数真菌免疫调节蛋白同源性低，是一种新型的免疫调节和抗肿瘤生物制剂。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种免疫调节蛋白及其基因。
技术介绍
：从真菌中获得的免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory proteins,以下简称为FIPs)是一类具有增强免疫力、抗过敏、抗肿瘤等多种重要的生理功能的小分子蛋白质。通过基因工程方法从已完成基因组测序的真菌中获得可开发利用的FIPs蛋白，既能丰富FIPs家族的种类，更能为人类健康的保健和治疗提供新的免疫调节剂。
技术实现思路
：本专利技术的目的是从已完成基因组测序的真菌中获得可开发利用的FIPs蛋白。本专利技术人通过生物信息学方法筛选到一种来源于真菌Stachybotrys chlorohalonata IBT 40285的蛋白FIP-sch2，为典型的免疫调节蛋白。所述真菌免疫调节蛋白FIP-sch2，全长112个氨基酸，理论分子量为12.555kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。FIP-sch2蛋白是一种新型的真菌免疫调节蛋白。本专利技术人通过将其氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现：FIP-sch2蛋白与小孢灵芝、赤灵芝、紫灵芝和金针菇真菌免疫调节蛋白GMI、FIP-gja、LZ-8和FIP-fve的序列同源性仅分别为59.5％、52.3％、54.1％和53.6％。说明FIP-sch2是一种新的真菌免疫调节蛋白。本专利技术还提供并合成了编码上述真菌免疫调节蛋白FIP-sch2的基因：通过一对引物FIP-sch2-F(EcoRI)：5'-CCC GAA TTC TCA GCT CCA ACC-3'和FIP-sch2-R(XhoI)：5'-AAA AAA CTC GAG CTT CCA TTG G-3'，用基因合成的方法克隆了这一真菌免疫调节蛋白FIP-sch2的基因，DNA全序列分析结果表明，fip-sch2全长339bp，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术还提供了包含蛋白FIP-sch2基因的重组表达载体。方法是将本专利技术的真菌免疫调节蛋白FIP-sch2基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。优选的表述载体是pGEX-6T-1。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是pGEX-6T-1上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠表达载体pGEX-fip-sch2。将上述重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌。所述宿主细胞优选为大肠杆菌Rosetta，得到重组菌株Rosetta(pGEX-fip-sch2)。本专利技术还提供了包含真菌免疫调节蛋白FIP-sch2基因的重组菌株，优选为重组菌株Rosetta(pGEX-fip-sch2)。本专利技术还提供了制备真菌免疫调节蛋白FIP-sch2的方法，包括以下步骤：1)将含FIP-sch2基因的重组表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组真菌免疫调节蛋白FIP-sch2的表达；以及3)回收并纯化所表达的真菌免疫调节蛋白FIP-sch2。本专利技术通过以下实验证实了本专利技术发现的新蛋白的功能。1、体外抗肿瘤活性实验结果：FIP-sch2对肺腺癌A549细胞具有毒性作用，半致死计量IC50为9.48μg/mL(图2)；8μg/ml的不同来源的真菌免疫调节蛋白比较实验结果表明，FIP-sch2对A549的毒性作用与灵芝免疫调节蛋白LZ-8相当，显著高于金针菇免疫调节蛋白FIP-fve。结论：FIP-sch2对肿瘤细胞具有极强的高毒性作用(实施例3)。2、诱导肿瘤细胞凋亡分析实验结果：FIPs对A549细胞具有凋亡作用，8μg/ml的FIP-sch2、LZ-8和FIP-fve处理A549细胞24h后，凋亡率分别为50.19％、38.82％、10.88％(图3)。结论：FIP-sch2对肿瘤细胞A549具有凋亡作用，其诱导凋亡作用与LZ-8相似，却显著高于FIP-fve，是极具潜力的抗肿瘤药物(实施例4)。3、抑制肿瘤细胞迁移检测实验结果：8μg/ml的FIP-sch2促进伤口愈合情况略强于LZ-8，显著弱于FIP-fve。结论：FIP-sch2可以抑制肿瘤细胞A549迁移，FIP-sch2对A549的迁移抑制作用略微弱于LZ-8，却显著强于FIP-fve。本专利技术优点和有益效果：1、可以提供相当数量的免疫调节蛋白质FIP-sch2纯品，完全能满足临床与医药应用需求。FIP-sch2在该大肠杆菌表达系统中实现高效表达，表达量为31mg/L(实施例2)；经柱纯化后，蛋白质的含量达到电泳纯(图1)。而目前通常从几千克食用菌中只能提取毫克级蛋白。2、FIP-sch2具有抗肿瘤活性，具有治疗应用潜力。抗肿瘤效应检测结果表明，FIP-sch2对A549具有毒性作用(实施例3)，可以诱导A549凋亡(实施例4)，抑制A549迁移(实施例5)；其抗肿瘤效应与灵芝免疫调节蛋白LZ-8相当，但显著高于金针菇免疫调节蛋白FIP-fve，极具应用潜力。3、首次运用基因工程手段提供了一个新的真菌来源的免疫调节蛋白。由于运用基因工程手段来产业化生产真菌免疫调节蛋白FIP-sch2产品还未见报道。本专利技术首次提供了一个新的真菌来源的免疫调节蛋白FIP-sch2。而且，根据本专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产真菌免疫调节蛋白FIP-sch2。附图说明：图1～图4是对本专利技术纯化制备的真菌免疫调节蛋白FIP-sch2进行分析和功能实验，其中：图1是superdex 75凝胶过滤和SDS-PAGE分析：其中，图1a为superdex 75凝胶过滤分析，推测FIP-sch2活性蛋白为二聚体；图1b为SDS-PAGE分析。图2是FIP-sch2蛋白抑制肿瘤细胞A549增殖结果。图3是FIP-sch2蛋白诱导肿瘤细胞A549凋亡结果。图4是FIP-sch2蛋白抑制肿瘤细胞A549迁移结果。具体实施方式以下实施例仅用于举例说明本专利技术的方法，并不限制本专利技术的范围。试验材料1、细胞株：人肺腺癌细胞A549，购买于北京协和医院细胞资源中心。2、试剂耗材CCK试剂盒：全式金细胞活性检测试剂盒；TransDetctTM Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit：全式金细胞凋亡检测试剂盒；PCR引物合成和基因测序均由上海生工生物公司完成；酶类：内切酶EcoRI和XhoI购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司；Prescission Protease由实验室制备；仪器：离心机、振荡摇床、显微镜、酶标仪、流式细胞仪；生化试剂：氨苄青霉素、青霉素(钠盐)、硫酸链霉素、溴酚兰、噻唑兰(MTT)、胎牛血清(FBS)，二甲基亚砜(DMSO)为Sigma产品。3、培养基高糖DMEM培养液，加入10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，0.22μm滤膜过滤灭菌后4℃保存。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。本实施例中的抗肿瘤效应检测，均以灵芝免疫调节蛋白(LZ-8)和金针菇免疫调本文档来自技高网...

【技术保护点】
氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的免疫调节蛋白。

【技术特征摘要】
1.氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的免疫调节蛋白。2.含权利要求1所述蛋白的制剂。3.权利要求1所述的蛋白在制备免疫调节剂和抗肿瘤制剂中的应用。4.权利要求3所述的应用，所述肿瘤是肺癌。5.编码权利要求1所述蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。6.含权利要求2所述基因的重组表达载体。7.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李淑英，辛凤姣，王凤忠，江中豪，孙丽超，黄颖，刘欣，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11