本发明专利技术公开了一种菌及其获取方法和应用。该菌是具有联产1,3‑丙二醇和D‑乳酸的特性。进一步地该菌为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，包括产酸克雷伯氏菌PDL‑5CCTCC M 2016185。该菌的获取方法可以是通过直接从环境中筛选满足条件的野生菌，或者对野生菌进行基因工程改造。本发明专利技术的有益效果是通过发酵该菌可以联产1,3‑丙二醇和D‑乳酸，且两种产物都具有很高摩尔转化率和高浓度，同时副产物种类少且浓度低，有利于简化产物提取过程，可实现1,3‑丙二醇和D‑乳酸的高效生物法生产，具有很大的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种菌及其获取方法和应用。这里的获取方法包括对人工菌的构建方法和对野生菌的筛选方法。
技术介绍
石油基聚合物为人们的生产生活带来了极大的便利。但是，随着石化资源的日益减少，以及使用石化资源带来的环境问题，寻找新的环境友好的非石油基聚合物受到越来越多的重视。生物基材料具有易生物降解、原料来源广和易化学改良等优点，使其在很多领域中都有重要的应用。目前，聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚乳酸(PLA)是受关注度较高的两种生物基材料。PTT是一种性能优异的聚酯类新型纤维，由对苯二甲酸和1,3-丙二醇(1,3-PD)缩聚而成，它综合了聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)的优势，具有很好的柔软性、蓬松性、抗污性、弹性和可以常温染色等特点，可以广泛用于服装、装饰和工程塑料等各个领域。PLA也称为聚丙交酯，是以乳酸(LAC)为主要原料聚合得到的聚合物，它具有较好的热稳定性、抗溶剂性和生物相容性，可进行多种方式的加工，可用于制造包装材料、纤维和非织造物等在服装、建筑、农业和医疗卫生等领域用途广泛。此外，PLA制品具有良好的生物可降解性，使用后能被自然界中微生物完全降解，是公认的环境友好材料。生物基材料PTT和PLA巨大的市场需求，推动了生物法生产生物基材料单体1,3-PD和光学纯LAC的发展。目前生物法生产1,3-PD的方法主要分为两类：第一类是利用基因工程大肠杆菌，以葡萄糖等糖类为底物，生产1,3-PD(例如CN201110093628；ZL200710104008)；第二类是利用肠道细菌，以甘油为底物，生产1,3-PD(ZL200410100479；CN201180064621)。最近，由于生物柴油产业的发展，甘油作为其副产物，价格逐渐下降，是1,3-PD生产的理想底物。可利用甘油为底物生产1,3-PD的菌株主要包括肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)等。用于生产PLA的LAC必须具有高光学纯度，因此，研究者筛选得到了很多可生产光学纯LAC的细菌，例如鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)和土芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus terrae)等野生细菌，都可以以糖类为原料生产高浓度的光学纯L-乳酸(L-LAC)或D-乳酸(D-LAC)(ZL200710176057；ZL201210115365；CN201410022868)。利用上述的菌株和生产方法，可实现1,3-PD和LAC中一种化合物的生物法生产，但是，目前尚无可同时生产1,3-PD和光学纯LAC(L-LAC或D-LAC)的菌株。肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌在以甘油为底物，生产1,3-PD的过程中，还会生产少量的2,3-丁二醇、乙醇、LAC、琥珀酸、乙酸和甲酸等副产物，虽然这两种菌株发酵甘油的发酵液中，同时具有1,3-PD和LAC，但由于两种化合物的浓度差距大(一般不在同一数量级)导致其中一种化合物只能被当做副产物处理，且醇类产物和酸类产物种类多，成分复杂，难以分离得到高纯度的LAC，无法实现同时生产1,3-PD和LAC。在工业化大规模生产中，必须考虑产物浓度、转化率，提取成本等因素，如果能够利用一个菌株，以甘油为底物，以1,3-PD和光学纯LAC(L-LAC或D-LAC)为主要产物，高转化率的实现同时生产1,3-PD和光学纯LAC(L-LAC或D-LAC)，将大大降低生产成本，提高生产效率。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种菌，所述菌具有联产1,3-丙二醇和D-乳酸的特性。联产是指同时生产。进一步地，所述菌是由野生菌改造获得的人工菌。进一步地，所述野生菌具有如下代谢途径：1)甘油→1,3-丙二醇；和/或2)甘油→丙酮酸→D-乳酸；所述野生菌还具有如下代谢途径中一个或多个：3)丙酮酸→α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸合成酶(budB)是催化该代谢途径的酶；4)α-乙酰乳酸→乙偶姻，α-乙酰乳酸脱羧酶(budA)是催化该代谢途径的酶；5)丙酮酸→乙酸，丙酮酸氧化酶(poxB)是催化该代谢途径的酶；6)乙酰辅酶A→乙酰磷酸，乙酰磷酸转移酶(pta)是催化该代谢途径的酶；7)乙酰磷酸→乙酸，乙酰激酶(ackA)是催化该代谢途径的酶；8)乙酰辅酶A→乙醛，醛脱氢酶(adhE)是催化该代谢途径的酶；9)富马酸→琥珀酸，富马酸还原酶(frdA)是催化该代谢途径的酶；所述改造包括：阻断所述代谢途径中的3)－9)中的一个或多个。进一步地，所述野生菌为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。进一步地，所述野生菌为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PDL-0，所述产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)PDL-0于2016年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC M 2016184。进一步地，所述改造包括：通过抑制或去除酶的活性来阻断所述代谢途径中的3)－9)中的一个或多个。进一步地，所述改造包括：通过改变酶的基因来抑制或去除酶的活性。进一步地，所述改造包括：通过基因重组的办法来改变酶的基因。进一步地，编码α-乙酰乳酸脱羧酶基因的序列如SEQ ID NO:1所示；编码α-乙酰乳酸合成酶基因的序列如SEQ ID NO:2所示；编码醛脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO:3所示；编码乙酸激酶和乙酰磷酸转移酶基因的序列如SEQ ID NO:4所示；编码丙酮酸氧化酶基因的序列如SEQ ID NO:5所示；编码富马酸还原酶基因的序列如SEQ ID NO:6所示。进一步地，所述人工菌的budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB和frdA中的一种基因或者多种基因缺陷。在一个较佳实施方式中，所述人工菌的budA、budB基因缺陷。在另一个较佳实施方式中，所述人工菌的budA、budB和adhE基因缺陷。在又一个较佳实施方式中，所述人工菌的budA、budB、adhE和ackA-pta基因缺陷。进一步地，所述基因缺陷通过同源重组的方法产生。进一步地，所述人工菌的基因型包括ΔbudAΔbudBΔadhEΔackA-ptaΔpoxBΔfrdA。ΔbudAΔbudBΔadhEΔackA-ptaΔpoxBΔfrdA表示α-乙酰乳酸脱羧酶基因(budA)、α-乙酰乳酸合成酶基因(budB)、醛脱氢酶基因(adhE)、乙酸激酶和乙酰磷酸转移酶基因(ackA-pta)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)和富马酸还原酶基因(frdA)缺陷或突变。优选地，所述人工菌的基因型是ΔbudAΔbudBΔadhEΔackA-ptaΔpoxBΔfrdA。从另一角度描述，所述人工菌是由所述野生菌的budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB和frdA基因缺陷获得；所述人工菌产1,3-PD和D-LAC，且1,3-PD和D-LAC的总转化率超过90％。总转化率计算公式为：总转化率本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种菌，其特征在于，所述菌具有联产1,3‑丙二醇和D‑乳酸的特性。
【技术特征摘要】
1.一种菌，其特征在于，所述菌具有联产1,3-丙二醇和D-乳酸的特性。2.如权利要求1所述的菌，其特征在于，所述菌是由野生菌改造获得的人工菌；所述野生菌具有如下代谢途径：1)甘油→1,3-丙二醇；和/或2)甘油→丙酮酸→D-乳酸；所述野生菌还具有如下代谢途径中一个或多个：3)丙酮酸→α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸合成酶是催化该代谢途径的酶；4)α-乙酰乳酸→乙偶姻，α-乙酰乳酸脱羧酶是催化该代谢途径的酶；5)丙酮酸→乙酸，丙酮酸氧化酶是催化该代谢途径的酶；6)乙酰辅酶A→乙酰磷酸，乙酰磷酸转移酶是催化该代谢途径的酶；7)乙酰磷酸→乙酸，乙酰激酶是催化该代谢途径的酶；8)乙酰辅酶A→乙醛，醛脱氢酶是催化该代谢途径的酶；9)富马酸→琥珀酸，富马酸还原酶是催化该代谢途径的酶；所述改造包括：阻断所述代谢途径中的3)－9)中的一个或多个。3.如权利要求2所述的菌，其特征在于，所述野生菌为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。4.如权利要求3所述的菌，其特征在于，所述人工菌的budA、budB、adhE、ackA-pta、poxB和frdA中的一种基因或者多种基因缺陷。5.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：许平，辛波，陶飞，王钰，唐鸿志，马翠卿，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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