RNA结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法技术

本发明专利技术提供了RNA结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法，该方法操作简单方便、样本需求量低、质量稳定可靠、且安全无害，采用磁珠法提取核酸，包括裂解、结合、洗涤、洗脱的步骤，还包括将所述RNA结合蛋白黏附于磁珠表面的步骤。本发明专利技术的RNA提取技术预先将RNA结合蛋白黏附于氧化硅纳米磁珠表面，保证了氧化硅纳米磁珠能够高效地结合RNA核酸分子；本发明专利技术操作简单方便，样本需求量低，质量稳定可靠，且避免使用氯仿等有毒溶剂，安全无害，为提取高浓度、高质量RNA作出保障。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种利用RNA结合蛋白交联磁珠提取RNA的技术。
技术介绍
对核酸的提取方法一直是生物学领域研究者不断努力探索的内容。传统的核酸提取方法主要有：CTAB抽提法、酚抽提法和梯度离心法，传统离心法操作步骤复杂、成本高、回收率低且涉及多数有毒试剂，不具环保性质。随着科学技术的发展，传统的核酸提取技术逐步为新型核酸提取技术所取代，新型核酸提取技术主要表现为固相载体吸附。常见有：离子交换法、离心柱提取法、磁珠法、玻璃珠吸附法以及二氧化硅基质法。虽然核酸提取技术有了很大的进步，但随着市场应用的越来越广泛，一些新型核酸提取技术的缺点日益显著。如离心柱法提取核酸，提取过程需反复离心，损失多，难以实现高通量自动化。为了顺应高通量自动化的发展需要，磁珠提取核酸法越发深入人心，其原理是磁珠表面带有特定的活性基团，能够特异地结合核酸分子，并在外部磁场的作用下，有效地分离核酸，但磁珠法普遍见于对DNA的提取，对RNA的提取效果不佳。有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种RNA结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法，使其更具有产业上的利用价值。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供RNA结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法，该方法操作简单方便、样本需求量低、质量稳定可靠、且安全无害。本专利技术的RNA结合蛋白在提取核酸中的应用，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。进一步的，所述RNA结合蛋白在提取RNA中的应用。本专利技术的一种提取核酸的方法，利用RNA结合蛋白、采用磁珠法提取核酸，包括裂解、结合、洗涤、洗脱的步骤，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。进一步的，还包括将所述RNA结合蛋白附于磁珠表面的步骤。进一步的，利用RNA结合蛋白、采用磁珠法提取RNA，包括以下步骤：(1)向待提取RNA的样品中添加RNA裂解液并混匀、静置，取其上清液；(2)将已经活化偶联氨基酸的氨基磁珠做无菌处理，将纯化好的RNA结合蛋白透析备用；将经过无菌处理的氨基磁珠放置于磁力架上，以便分离；将透析后的RNA结合蛋白加入到氨基磁珠中，混合均匀后在16℃摇床中反应3h；置于磁力架分离，取上清，跑RNA结合蛋白结合反应前后SDS胶、检测结合反应前后蛋白浓度，以计算结合效率；已黏附RNA结合蛋白的氨基磁珠在4℃(冰浴)条件下，用含有PBS及0.1％TritonX的洗涤缓冲液洗涤，并于磁力架分离，弃上清；再用PBS洗涤缓冲液洗涤，于磁力架分离，弃上清；黏附RNA结合蛋白的氨基磁珠置于1ml PBS(磷酸缓冲盐溶液)，0.5％BSA(牛血清白蛋白)，2mM EDTA，0.05％Proclin，pH7.4保存液中，得到氨基磁珠悬浮液，并4℃无菌储存；(3)向步骤(1)中的上清液添加到步骤(2)中的氨基磁珠悬浮液，并进行磁吸附，然后去除其清液，得沉淀；(4)步骤(3)中的沉淀经洗涤、磁吸附、洗脱、磁吸附后，取其上清液，得到目标产物。进一步的，步骤(1)中，所述RNA裂解液为RNAiso Plus。进一步的，步骤(2)中，所述氨基磁珠悬浮液中包括偶联Protein A的氨基磁珠、2mg/ml的RNA结合蛋白，其中氨基磁珠含量为40mg/ml，直径为1.5mm。更进一步的，所述磁珠为氧化硅纳米磁珠。进一步的，步骤(4)中，洗涤液分别是0.02mol/L Tris DEPC水，pH6.8以及75％的无水乙醇，两者均以DEPC水为溶剂。进一步的，步骤(4)中，洗脱液为DEPC水。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术提供的一种高质量、简便、低成本的RNA提取技术；RNA结合蛋白预先黏附于氧化硅纳米磁珠表面，保证了氧化硅纳米磁珠能够高效地结合RNA核酸分子；本专利技术操作简单方便，样本需求量低，质量稳定可靠，且避免使用氯仿等有毒溶剂，安全无害；用磁珠法专一性地提取RNA，氧化硅纳米磁珠能特异地识别且高效结合核酸分子，并在磁场等作用下，从各组织中抽离出RNA，高效结合RNA核酸分子，为提取高浓度、高质量RNA作出保障。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术中RNA结合蛋白成功黏附于氨基磁珠上的示意图；图2是本专利技术的实施例一中琼脂糖凝胶电泳跑胶检测示意图；图3是本专利技术的实施例二中琼脂糖凝胶电泳跑胶检测示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例一氨基磁珠黏附RNA结合蛋白得到氨基磁珠悬浮液，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，包括以下步骤：(1)将1ml已经活化偶联好Protein A的氨基磁珠，用无菌缓冲液PBS，20％乙醇，pH7.4浸泡16h，然后用无菌结合缓冲液PBS，PH7.4洗涤3次，做无菌处理；(2)将纯化好的RNA结合蛋白透析至结合缓冲液PBS，PH7.4，备用；(3)将经过无菌处理的氨基磁珠用磁力架分离10min，丢弃上清；(4)将2mg透析后的RNA结合蛋白加入到氨基磁珠中，混合均匀后在16℃摇床中反应3h；(5)用磁力架分离10min，取上清，跑RNA结合蛋白结合反应前后SDS胶、检测结合反应前后蛋白浓度，以计算结合效率；(6)已结合RNA结合蛋白的磁珠在4℃(冰浴)条件下，用1ml PBS，0.1％TritonX，pH7.4洗涤缓冲液洗涤两次，用磁力架分离10min，弃上清；(7)黏附RNA结合蛋白的氨基磁珠在4℃(冰浴)条件下，用1ml PBS，pH7.4洗涤缓冲液洗涤两次，用磁力架分离10min，弃上清；(8)黏附RNA结合蛋白的氨基磁珠用1ml PBS(磷酸缓冲盐溶液)，0.5％BSA(牛血清白蛋白)，2mM EDTA，0.05％Proclin，pH7.4保存液4℃储存，如图1所示，RNA结合蛋白已成功黏附于氨基磁珠上。提取细胞液中的RNA，包括以下步骤：(1)取1ml HEK293细胞(转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系)液样本于1.5ml经DEPC水处理的EP管，添加400μl Takara公司提供的裂解液RNAiso Plus，震荡混匀，静置3min，4000rpm，离心6min，取上清液；(2)向步骤(1)的上清液中添加35μl的氧化硅纳米氨基磁珠悬浮液(其中氨基磁珠含量为40mg/ml，直径为1.5mm)，12000rpm，离心3min，放置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃上清液；(3)将经步骤(2)处理的离心管从磁力架上取下，加入500μl洗涤液Ⅰ(0.02mol/L Tris DEPC水溶液，pH 6.8)，混合均匀，静置3min，12000rpm，本文档来自技高网...

【技术保护点】
RNA结合蛋白在提取核酸中的应用，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.RNA结合蛋白在提取核酸中的应用，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述RNA结合蛋白在提取RNA中的应用。3.一种提取核酸的方法，其特征在于：利用RNA结合蛋白、采用磁珠法提取核酸，包括裂解、结合、洗涤、洗脱的步骤，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的提取核酸的方法，其特征在于：还包括将所述RNA结合蛋白附于磁珠表面的步骤。5.根据权利要求3或4所述的提取核酸的方法，其特征在于，利用RNA结合蛋白、采用磁珠法提取RNA，包括以下步骤：(1)向待提取RNA的样品中添加RNA裂解液并混匀、静置，取其上清液；(2)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：张清仪，周燕，刘杰，石加加，
申请(专利权)人：吴江近岸蛋白质科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32