微生物发酵生产甘油酸的菌株HD1025和方法技术

本发明专利技术涉及一种从腐烂水果中筛选出的微生物菌株Gluconobacter japonicas HD1025，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter japonicus）该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.12425。本发明专利技术还给出了利用该菌株生产甘油酸的方法。该菌株好氧发酵转化50‑200 g/L的甘油，最高可以生产52.39 g/L的甘油酸，极具工业化生产价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制造
，具体涉及一种用好氧微生物发酵甘油生产甘油酸的菌株HD1025和利用该菌株生产甘油酸的方法。
技术介绍
甘油酸是甘油氧化形成的三碳醇酸又称2,3-二羟基丙酸，它是一种有机酸，其英文名为Glyceric acid，简写为GA，分子式为C3H6O4，甘油酸存在于自然界各种各样的植物中，并且作为一种中间代谢物同样也存在于人体内。据文献报道，甘油酸及其衍生物具有很多重要的生物学功能。例如：在人体内D-甘油酸能使胃部细胞在一定剂量乙醇刺激后增强活力从而促进乙醇分解代谢（2007 Eriksson等在老鼠体内证实）因此其可以作为解酒药的成分（P·海诺在2003年发表的专利中阐述了D-甘油酸作为解酒药的作用机理）。此外也有报道称在狗体内的甘油酸具有促进胆固醇活性和肝兴奋剂的功能；甘油酸衍生出的酯类低聚物能表现出抗胰蛋白酶活性；同时甘油酸由于其生物可降解性优于其他的一些高聚物，因此其可能运用于药物的运输载体。在食品方面甘油同样具有很多作用，例如：甘油酸加入冰淇淋中可以使各组分混合均匀，口感细腻润滑，并且可以延缓冰淇淋的融化。甘油酸的生产方法有化学法和生物法两种。但是，由于生物法报道较少，目前市场上销售的甘油酸大部分是通过化学方法生产而来。相比生物法，化学方法具有成本高、耗能大、产量低并且不具有立体选择性等缺点。利用微生物发酵法生产甘油酸，环境温和、产量高、方法简便而且产物具有立体选择性，因此越来越受到关注。甘油酸的生产主要是利用含有醇脱氢酶和醛脱氢酶的微生物以甘油为底物来生产。目前报道的能够生产甘油酸酸的菌株部分如下：G. thailandicus NBRC3172、G. Oxydans NBRC3292、G. Oxydans NBRC3292、G. frateurii NBRC3262、GluconobacterspNBRC3259、Acetobacter tropicalis NBRC16470、Gluconobacter frateurii NBRC103465等。国外有关微生物法生产甘油酸的报道较少，在国内尚无任何有关甘油酸生产以及生产甘油酸菌株筛选的报道。因此甘油酸的工业化生产还面临很多重要的困难，其中之一就是高产菌株的筛选。因此，自主创新地筛选出能够耐受高浓度甘油的微生物菌株，并且研究出一种能够生产高浓度甘油酸的方法迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株能够耐受高浓度的甘油且能以廉价的甘油为原料产生大量甘油酸的新菌株HD1025，该菌株可用于微生物发酵生产甘油酸。本专利技术还给出了利用该菌株发酵生产甘油酸的方法，该方法以甘油为原料。一种微生物发酵生产甘油酸的菌株HD1025，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter japonicus）该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.12425。保藏日期为2016年05月09日；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。上述的菌株HD1025是从腐烂的水果中筛选而出，能有效氧化甘油生产甘油酸。采用上述菌株HD1025生产甘油酸的方法，其包括如下步骤：将菌株HD1025按1～10%的接种量接入液体发酵培养基，在好氧条件下于25～30℃发酵培养60～84h；所述液体发酵培养基组成为：50～200 g/L甘油，氮源6～20 g/L，0.1～1 g/L KH2PO4，0.1～1 g/L K2HPO4，1～5 g/L MgSO4·7H2O，20～35 g/L CaCO3，余量为水，培养基pH为5～7。或者，也可以将菌株HD1025先按1～10%的接种量接种到一级种子培养基中，于25～30℃好氧培养6～24 h；然后将培养好的一级种子按1～10%的接种量接入二级种子培养基中，8～10 h后将培养好的二级种子按1～10%的接种量再接入液体发酵培养基；其中，所述一级种子培养基和二级种子培养基的组成均为：葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH 6.5, 余量为水。具体的，所述的甘油为食品级甘油或医药级甘油。具体的，所述氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、尿素和无机铵盐（如硫酸铵、硝酸铵或氯化铵等）中的一种或两种以上的混合物。在本专利技术中，建立一种快速筛选高产甘油酸菌株的模型，具有醇脱氢酶和醛脱氢酶的微生物可以在以甘油为唯一碳源的筛选培养基上产生有机酸，该有机酸可以使得筛选培养基局部的pH发生变化，因此使得筛选培养基中的酸碱指示剂颜色发生变化，因此可以快速初步的筛选出产有机酸的菌株，然后再将该菌株接种于发酵培养基，培养基一段时间后利用高效液相色谱仪（HPLC）对发酵液进行定性和定量检测，进而复筛出高产甘油酸的菌株。本专利技术从腐烂的水果、蔬菜、污水和有机质丰富的土壤等样品中取样，制得菌液涂布于筛选培养基上培养。然后挑取周围培养基颜色发生变化的菌株接种于发酵培养基中，30℃培养2-3 d，取发酵液离心，稀释100倍，利用HPLC定性定量检测。经过对多个样品的大量菌株筛选工作，从分离出来的近数百株细菌中共初筛选出十几株产甘油酸的菌株，最后复筛得到遗传稳定性好的产甘油酸HD1025菌株。本专利技术筛选得到的能有效转化甘油生产甘油酸的微生物HD1025，经16S rRNA鉴定和根据伯杰氏细菌鉴定手册进行的生理生化鉴定，认为该菌株属醋酸菌科(Acetobacteraceae)葡糖杆菌属(Gluconobacter)的Gluconobacter japonicus。本专利技术方法的突出优点是利用廉价的甘油为原料来发酵生产高附加值产品甘油酸，该方法可持续生产，且对环境友好。附图说明图1为Gluconobacter japonicus HD1025的平板菌落照片；图2为Gluconobacter japonicus HD1025的扫描电镜照片；图3为Gluconobacter japonicus HD1025的16S rDNA全序列测序结果；图4为基于BLAST结果构建的进化树。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步地详细介绍，但本专利技术的保护范围并不局限于此。以下给出了Gluconobacter japonicus HD1025菌株的筛选、鉴定及发酵生产甘油酸的具体过程。（一）菌株的筛选：1、初筛：从开封市区内不同地点取样，取样种类包括腐烂的水果、蔬菜、污水和有机质丰富的土壤等，共取样30份。将取得的样品进行研碎处理，将上述样品加入无菌水中，置于恒温摇床中进行振荡2 h，然后取上清菌液进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6三个梯度的菌液200 μL涂布于筛选培养基（甘油150 g/L，蛋白胨9 g/L，酵母粉1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，溴甲酚紫0.02 g/L，琼脂粉20 g/L；pH 6.5）中，于30℃恒温培养箱中培养2-4 d。挑取菌落形态相差较大且该菌落周围培养基颜色发生变化的单菌落进行再次复筛。复筛：将上述初筛所得的百余株菌株分批次接种于发酵培养基（甘油100 g/L，蛋白胨9 g/L，酵母粉1 g/L，KH2PO4 0.9 g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物发酵生产甘油酸的菌株HD1025，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter japonicus）该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.12425。

【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵生产甘油酸的菌株HD1025，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter japonicus）该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.12425。2.采用权利要求1所述菌株HD1025生产甘油酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将菌株HD1025按1～10%的接种量接入液体发酵培养基，在好氧条件下于25～30℃发酵培养60～84h；所述液体发酵培养基组成为：50～200 g/L甘油，氮源6～20 g/L，0.1～1 g/L KH2PO4，0.1～1 g/L K2HPO4，1～5 g/L MgSO4·7H2O，20～35 g/L CaCO3，余量为水，培养基pH为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇鹏，方亚坤，周配，张磊，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41