本发明专利技术公开了一种识别并结合人转铁蛋白受体的核酸适体序列及其应用。本发明专利技术的核酸适体及其衍生物可在识别转铁蛋白受体高表达肿瘤或者制备检测转铁蛋白受体高表达肿瘤的试剂盒、分子探针、靶向介质中应用，以及在设计和制备检测转铁蛋白受体的核酸探针的应用。本发明专利技术的核酸适体具有比已有技术更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生化分析
，具体涉及一种识别并结合人转铁蛋白受体的核酸适体序列及其应用。
技术介绍
转铁蛋白受体(transferrin receptor(TfR)，又叫CD71)是一种广泛存在于动物细胞中的跨膜糖蛋白，它是一种Ⅱ型同源二聚体糖蛋白(180kDa)，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，其主要功能是通过与转铁蛋白作用来介导铁元素的跨膜运输和内吞吸收。铁元素参与细胞内DNA的合成、细胞增殖、免疫调节及细胞内呼吸链中电子的传递等多个生理过程。转铁蛋白受体的表达量的高低与细胞对铁元素的需求密切相关。转铁蛋白受体在正常细胞上表达很低，代谢旺盛而需要大量铁元素的细胞和组织如分裂旺盛的上皮基底细胞、血脑屏障等都高表达转铁蛋白受体。研究发现，大多数肿瘤细胞如结肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、血液系统肿瘤和鼻咽癌等都高度表达转铁蛋白受体；恶性肿瘤预后较差也与转铁蛋白受体表达升高有关；因此，转铁蛋白受体的检测有助于肿瘤的鉴别和早期诊断。由于转铁蛋白受体在肿瘤细胞表面高度表达且其介导的跨膜转运途径转运效率高、靶向性好，因此它在肿瘤的靶向诊断和治疗中得到广泛研究和应用。同时，细胞表面的转铁蛋白受体的胞外区可经丝氨酸蛋白酶水解作用释放到血清中，这种可溶性转铁蛋白受体(sTfR)在血清中通常与不同的转铁蛋白以复合物的形式存在；铁缺乏时会引起sTfR合成的增加，测定sTfR可在临床上作为特异性检测指标用于缺铁性贫血的诊断。因此检测转铁蛋白受体对于疾病的诊断具有重要意义。目前转铁蛋白受体的主要检测方法是酶联免疫法吸附法，但其步骤繁琐、耗时长、价格昂贵、抗体活性批次差异大、易发生交互反应等；因此构建一种简便、经济、直观和特异的人转铁蛋白受体检测方法在临床诊断和治疗方面具有应用前景。核酸适体(aptamer)是一段由10～150个碱基组成的单链寡聚核苷酸，它能高结合力、高选择性识别某一种或某一类配体分子，被称作“能化学合成的抗体”(chemical antibody)。核酸适体可为DNA、RNA、肽核酸或其它经过化学修饰的核酸；由于核酸能借助范德华力、氢键、静电作用和疏水作用等分子间相互作用形成不同的三维结构，如发卡、假结、G-四链体等结构，因此核酸适体能够实现与靶标物质高亲和力、高特异性的结合作用。筛选与靶标物质高效、专一结合的核酸适体的技术叫做指数富集配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment，SELEX)技术。SELEX技术所筛选的核酸适体的靶标物质范围广泛，包括无机金属离子、有机小分子、生物大分子、以及病毒、细菌、细胞和组织切片等，迄今已报道了数百个核酸适体。利用SELEX技术能筛选出针对活细胞和组织等复杂靶标的核酸适体与单克隆抗体具有相似的识别功能，但与单克隆抗体相比，具有如下优点：(1)在体外筛选，无需免疫动物或细胞；(2)低毒性或免疫源性，水溶性好，可大剂量皮下静脉注射或病灶注射；(3)可进行大量化学合成制备，批间差异小；(4)易于结构改造、修饰、标记或固定化，增加血清中稳定性；(5)稳定性好，易保存和运输；(6)分子量小，一般在4-50KD。基于上述优点，核酸适体作为新型的仿生识别元素，已在疾病诊断与治疗、药物筛选、分子识别和分析检测等众多领域得到了广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种核酸适体。本专利技术提供的核酸适体为如下A)或B)：A)序列1所示的单链DNA分子；B)去除A)所示的核苷酸序列自5’端第1个核苷酸起包括5’端第一个核苷酸残基的1-20个核苷酸，且去除所述A)所示的核苷酸序列自3’端第1个核苷酸起包括3’端第一个核苷酸残基的10-20个核苷酸，保留的核苷酸残基组成的核酸适体。上述核酸适体中，B所示的核酸适体为如下1)-5)中任一种：1)序列2所示的单链DNA分子；2)序列6所示的单链DNA分子；3)序列5所示的单链DNA分子；4)序列4所示的单链DNA分子；5)序列3所示的单链DNA分子。本专利技术的另一个目的是提供上述核酸适体的衍生物。本专利技术提供的上述核酸适体的衍生物为如下(1)-(6)中任一种：(1)将上述核酸适体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(2)将上述核酸适体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(3)将上述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(4)由上述核酸适体编码的RNA分子，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(5)由上述核酸适体编码的肽核酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(6)将上述核酸适体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。上述衍生物中，所述修饰为磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化；所述功能基团为荧光基团、生物素基团、放射性物质、治疗性物质、地高辛、纳米发光材料或酶标记。上述衍生物中，所述核酸适体的衍生物为在序列2所示的核酸适体的5’端标记荧光素基团或花菁染料基团或生物素基团后得到的核酸适体的衍生物。本专利技术还有一个目的是提供一种核酸适体探针。本专利技术提供的核酸适体探针为将上述核酸适体或上述衍生物负载在聚乙二醇修饰的氧化石墨烯上，得到核酸适体探针。上述核酸适体探针中，所述核酸适体或所述衍生物与聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的配比为1nmol：150mg。上述核酸适体探针中，所述探针按照如下方法制备：将荧光基团标记的核酸适体衍生物、聚乙二醇修饰的氧化石墨烯和缓冲液混匀，孵育，得到核酸适体探针。上述核酸适体探针中，所述荧光基团标记的核酸适体衍生物、所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯和缓冲液的配比为1nmol：150mg：1L。上述核酸适体探针中，所述荧光基团标记的核酸适体衍生物为在序列2所示的核酸适体的5’端标记荧光素基团(6-FAM)后得到的核酸适体的衍生物。上述核酸适体探针中，所述缓冲液的溶剂为水，溶质及其在缓冲液中的浓度为10mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM KCl和2mM MgCl2。上述核酸适体探针中，所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯中，聚乙二醇在氧化石墨烯表面的接枝量为51％。上述核酸适体探针中，所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的具体制备方法如下：将氧化石墨烯在二甲基甲酰胺中超声分散，得到分散液；将聚乙二醇与分散液中超声10min，再加入一定量的DCC/DMAP(DCC和DMAP物质的量比为5:1)作为催化剂，超声30min后，在60℃反应12h，将分散液在透析袋中透析1周，除去游离的PEG和催化剂，经冷冻干燥后，得到聚乙二醇修饰的氧化石墨烯。本专利技术的最后一个目的是提供上述核酸适体或上述核酸适体的衍生物或上述核酸适体探针的新用途。本专利技术提供了上述核酸适体或上述核酸适体的衍生物或上述核酸适体探针在如下(B1)-(B10)中至少一种中的应用：(B1)识别或辅助识别转铁蛋白受体；(B2)结合或辅助结合转铁蛋白受体；(B3)检测或辅助检测待测样品中是否含有转铁蛋白受体；(B4)制备检测或辅助检测待测样品中是否含有转铁蛋白受体的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核酸适体，为如下A)或B)：A)序列1所示的单链DNA分子；B)去除A)所示的核苷酸序列自5’端第1个核苷酸起包括5’端第一个核苷酸残基的1‑20个核苷酸，且去除所述A)所示的核苷酸序列自3’端第1个核苷酸起包括3’端第一个核苷酸残基的10‑20个核苷酸，保留的核苷酸残基组成的核酸适体。
【技术特征摘要】
1.一种核酸适体，为如下A)或B)：A)序列1所示的单链DNA分子；B)去除A)所示的核苷酸序列自5’端第1个核苷酸起包括5’端第一个核苷酸残基的1-20个核苷酸，且去除所述A)所示的核苷酸序列自3’端第1个核苷酸起包括3’端第一个核苷酸残基的10-20个核苷酸，保留的核苷酸残基组成的核酸适体。2.根据权利要求1所述的核酸适体，其特征在于：B所示的核酸适体为如下1)-5)中任一种：1)序列2所示的单链DNA分子；2)序列6所示的单链DNA分子；3)序列5所示的单链DNA分子；4)序列4所示的单链DNA分子；5)序列3所示的单链DNA分子。3.权利要求1或2所述核酸适体的衍生物，为如下(1)-(6)中任一种：(1)将权利要求1或2所述的核酸适体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(2)将权利要求1或2所述的核酸适体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(3)将权利要求1或2所述的核酸适体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(4)由权利要求1或2所述的核酸适体编码的RNA分子，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(5)由权利要求1或2所述的核酸适体编码的肽核酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；(6)将权利要求1或2所述的核酸适体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。4.根据权利要求3所述的衍生物，其特征在于：所述核酸适体的衍生物为在序列2所示的核酸适体的5’端标记荧光素...
【专利技术属性】
技术研发人员：上官棣华，张楠，邴涛，刘祥军，沈璐瑶，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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