布鲁氏菌分子标记缺失菌株及其构建方法技术

布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)及其构建方法，属于布鲁氏菌新型分子标记疫苗研究领域。该菌株保藏号为CGMCC No.11908，缺失了布鲁氏菌强毒株16M与毒力相关的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase。PCR扩增UGPase基因上下游同源臂序列获得两个基因片段，经融合、双酶切后与自杀载体质粒pBK CMV‑SacB连接得到缺失突变载体pBK CMV SacB‑UGPase‑NC，电转化入布鲁氏菌中筛选培养，最终得到布鲁氏菌UGPase缺失菌株。该疫苗株可作为新型布鲁氏菌病疫苗候选菌株用于控制布鲁氏菌病的流行和传播，为新型布鲁氏菌疫苗研制奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于布鲁氏菌新型分子标记疫苗研究
，具体涉及一种布鲁氏菌分子标记缺失菌株及其构建方法。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人畜共患传染病。布鲁氏菌属有7个种，感染人的主要有牛、羊、猪、犬及海洋动物5个种。布鲁氏菌是革兰氏阴性菌，主要引起人的波状热和慢性感染以及反刍动物的不育和流产。我国目前对布鲁氏菌病防控的有效措施是通过血清学检测，筛选阴性动物进行疫苗免疫。然而现有的疫苗免疫后产生的抗体与自然感染的动物抗体无法区分，也就是说通过血清学检测方法无法有效区分自然感染和疫苗免疫的动物，严重妨碍了动物布鲁氏菌病的净化，造成了目前人畜布鲁氏菌病感染率逐年上升的严重后果。目前许多学者都在研究分子标记疫苗，即通过基因缺失技术，将布鲁氏菌已知的关键毒力基因进行缺失，获得新的具有标记的弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株进行免疫方可通过缺失基因的标记性抗体进行鉴别诊断达到防控布鲁氏菌病的目的。然而学者们对于布鲁氏菌分子标记疫苗株的研究还处于实验室研究阶段，多个分子标记的布鲁氏菌毒株都是在弱毒疫苗株的基础上进行改造获得的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过缺失布鲁氏菌强毒株16M与毒力相关的UGPase基因获得新的布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)及其构建方法。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)，该布鲁氏菌分子标记缺失菌株于2016年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.11908，分类命名为羊布鲁氏菌Brucella melitensis。本专利技术的布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)，该菌株缺失了布鲁氏菌强毒株16M与毒力相关的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase，缺失掉的UGPase基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:4所示。本专利技术还提供了上述布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)的构建方法，PCR扩增布鲁氏菌强毒株16M的UGPase基因上、下游同源臂序列，对获得的两个基因片段进行融合，得到缺失突变盒UGPase-NC，双酶切缺失突变盒UGPase-NC后与自杀载体质粒pBK CMV-SacB连接，得到缺失突变载体pBK CMV SacB-UGPase-NC，根据同源重组的原理，将其电转化入布鲁氏菌强毒株16M感受态细胞中培养，通过正、负向筛选同源重组双交换子，筛选出布鲁氏菌分子标记缺失菌株B.melitensis△UGPase，用菌落PCR及DNA测序的方法进行验证，结果表明，布鲁氏菌UGPase基因缺失株改造成功。作为优选的实施方式，PCR扩增布鲁氏菌强毒株16M的UGPase基因上、下游同源臂序列获得两个基因片段，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。作为优选的实施方式，本专利技术的布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)的构建方法具体包括以下步骤：步骤一、根据布鲁氏菌强毒株16M的UGPase基因上下游片段、蔗糖筛选基因sacB基因片段、UGPase基因片段及pBK-CMV载体所含酶切位点，设计引物：UGPaseF1：5'-GGATCCCTGGAGCCACTGCCCCCATTTG-3'UGPaseR1：5'-CTCGAGTCCTCTCCTCGATTTTCATTCA-3'UGPaseF2：5'-CTCGAGTAATCGGGCTATCCAATATCGC-3'UGPaseR2：5'-TCTAGACCACAGTGAATGCGGAAACCAG-3'sacB F：5'-GTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAGACAT-3'sacB R：5'-GGATCCTGGGATTCACCTTTATGTTGATAAG-3'UGPase 1：5'-ATGAGTTCTATTCGGAAAATCCGC-3'UGPase 2：5'-TCAGGCTGGCTGGATCGTCT-3'；步骤二、以布鲁氏菌强毒株16M的基因组DNA为模板，PCR扩增UGPase基因的上、下游同源臂序列，获得两个长度分别为920bp和770bp的基因片段，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；步骤三、通过融合PCR将上述两个基因片段融合在一起，得到缺失突变盒UGPase-NC，用BamH I和Xho I双酶切缺失突变盒UGPase-NC后与含有蔗糖筛选基因sacB的自杀载体质粒pBK CMV-SacB连接，得到缺失突变载体pBK CMV SacB-UGPase-NC；步骤四、将缺失突变载体pBK CMV SacB-UGPase-NC电转化入布鲁氏菌强毒株16M感受态细胞中进行筛选培养；步骤五、通过正、负向筛选同源重组双交换子，筛选出布鲁氏菌分子标记缺失菌株B.melitensis△UGPase。作为优选的实施方式，本专利技术的布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)的构建方法还包括以下步骤：根据布鲁氏菌UGPase基因上下游同源臂的引物序列即引物UGPaseF1、引物UGPaseR1、引物UGPaseF2和引物UGPaseR2，利用PCR方法对布鲁氏菌UGPase基因缺失株进行鉴定，结果显示：布鲁氏菌UGPase基因缺失株得到的片段长度为1690bp，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:3所示，而野生型布鲁氏菌强毒株16M的基因片段长度为2584bp，说明UGPase基因已经缺失掉，布鲁氏菌UGPase基因缺失株构建成功。作为优选的实施方式，本专利技术的布鲁氏菌分子标记缺失菌株B.melitensis△UGPase的构建方法还包括以下步骤：采用布鲁氏菌UGPase基因上下游引物即引物UGPase 1和引物UGPase 2对布鲁氏菌UGPase基因缺失株进行PCR扩增，结果显示：布鲁氏菌UGPase基因缺失株的基因片段无特异性条带，而野生型布鲁氏菌强毒株16M的基因片段在894bp处有特异性条带，测序结果显示该特异性条带与布鲁氏菌UGPase基因序列100％同源。作为优选的实施方式，本专利技术的布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)的构建方法中，步骤四所述的电转化的具体过程为：首先将100ng的缺失突变载体pBK CMV SacB-UGPase-NC的DNA与30ul布鲁氏菌强毒株 16M感受态细胞充分混匀，预冷15min，然后于1500V、6ms电击条件下进行电击，电击后加入1ml SOC培养基重悬细菌，转入1.5ml离心管中，37℃复苏24h，复苏的转化产物涂布于含有50ug/ml卡那霉素的TSA平板。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用基因缺失技术，通过缺失布鲁氏菌强毒株16M与毒力相关的基因—尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)，成功构建出了一种布鲁氏菌UGPase基因缺失株。经实验研究结果表明，本专利技术的布鲁氏菌分子标记缺失菌株B.melitens本文档来自技高网...

【技术保护点】
布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)，其特征在于，该布鲁氏菌分子标记缺失菌株于2016年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11908。

【技术特征摘要】
1.布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)，其特征在于，该布鲁氏菌分子标记缺失菌株于2016年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11908。2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)，其特征在于，该菌株缺失了布鲁氏菌强毒株16M与毒力相关的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase，缺失掉的UGPase基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:4所示。3.权利要求1或2所述的布鲁氏菌分子标记缺失菌株(B.melitensis△UGPase)的构建方法，其特征在于，PCR扩增布鲁氏菌强毒株16M的UGPase基因上、下游同源臂序列，对获得的两个基因片段进行融合，得到缺失突变盒UGPase-NC，双酶切缺失突变盒UGPase-NC后与自杀载体质粒pBK CMV-SacB连接，得到缺失突变载体pBK CMV SacB-UGPase-NC，根据同源重组的原理，将其电转化入布鲁氏菌强毒株16M感受态细胞中培养，通过正、负向筛选同源重组双交换子，筛选出布鲁氏菌分子标记缺失菌株B.melitensis△UGPase，用菌落PCR及DNA测序的方法进行验证，结果表明，布鲁氏菌UGPase基因缺失株改造成功。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，PCR扩增布鲁氏菌强毒株16M的UGPase基因上、下游同源臂序列获得两个基因片段，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：步骤一、根据布鲁氏菌强毒株16M的UGPase基因上下游片段、蔗糖筛选基因sacB基因片段、UGPase基因片段及pBK-CMV载体所含酶切位点，设计引物：UGPaseF1：5'-GGATCCCTGGAGCCACTGCCCCCATTTG-3'UGPaseR1：5'-CTCGAGTCCTCTCCTCGATTTTCATTCA-3'UGPaseF2：5'-CTCGAGTAATCGGGCTATCCAATATCGC-3'UGPaseR2：5'-TCTAGACCACAGTGAATGCGGAAACCAG-3'sacB F：5'-GTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAGACAT-3'sacB R：5'-GGATCCTGGGATTCACCTTTATGTTGATAAG-3'UGPase 1：5'-ATGAGTTCTATTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨艳玲，王兴龙，钱晶，卜昭阳，郭利，李春义，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22