一种SLAMF6蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了利用真核细胞分泌表达SLAMF6蛋白的制备方法，包括步骤：(1)对SLAMF6蛋白进行序列优化；(2)通过真核抗性筛选，得到表达SLAMF6蛋白的细胞株；(3)对细胞株进行培养，得到细胞株分泌物SLAMF6蛋白。克服了传统的生产SLAMF6蛋白的方法为原核表达，表达差、复性困难，且纯化得到的蛋白缺乏糖基化，不能满足需求。本发明专利技术采用哺乳动物表达系统，通过对载体改造，HEK293细胞筛选出分泌表达该蛋白的细胞株，解决了SLAMF6蛋白表达差的问题，通过分泌表达克服了复性困难的问题，同时人的细胞表达人的重组蛋白，具有更准确的糖基化，满足了研发需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组蛋白，具体涉及SLAMF6蛋白的制备方法。
技术介绍
SLAMF6是一种单链膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族里的CD2亚家族。SLAMF6在所有的NK细胞、T细胞和B淋巴细胞中都有表达。SLAMF6是一个同源二聚体，SLAMF6与SH2D1A、SHPs共同介导了酪氨酸的磷酸化过程。SLAMF6作为协同受体在NK细胞的活化过程发挥重要作用，SLAMF6同样在淋巴增生患者来源的NK细胞中介导了抑制反应，故通过重组表达该蛋白、在体外研究该蛋白的功能就显得非常重要。按照宿主细胞类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统，通常情况下采用原核表达系统表达重组蛋白，该方法与其它系统相比简便快捷，成本较低。但是膜蛋白的原核表达绝大多数情况下表达出的蛋白为包涵体形式，而且复性困难，并且利用原核系统表达出的蛋白没有糖基化过程，很难生产出具有生物学功能的重组蛋白，传统的生产SLAMF6蛋白的方法为原核表达，表达差、复性困难，且纯化得到的蛋白缺乏糖基化，不能满足需求。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。如今，哺乳动物表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台，如抗体、生长因子、凝血因子、疫苗等。有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种SLAMF6蛋白的制备方法，使其更具有产业上的利用价值。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种表达量高且具有完全生物学活性的SLAMF6蛋白的制备方法。本专利技术的SLAMF6蛋白的制备方法，包括将SLAMF6蛋白中基因进行序列优化的步骤。进一步的，SLAMF6蛋白的制备方法包括以下步骤：(1)对SLAMF6蛋白中基因进行序列优化，获得最适真核系统表达的序列，所述SLAMF6蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(2)通过真核抗性筛选，得到稳定高效表达SLAMF6蛋白的细胞株，真核抗性筛选方法为通过逐步改变真核抗生素的浓度，得到高表达的混合克隆；(3)对细胞株进行培养，优化细胞培养工艺，得到细胞株分泌物SLAMF6蛋白，提高重组蛋白的分泌和表达；细胞液在温度37℃、湿度≥70％、CO2浓度8％、转速110rmp的细胞培养箱内培养72h，然后转移至温度34℃、湿度≥70％、CO2浓度8％、转速110rmp的低温培养箱内培养，在培养72h和120h时分别取细胞液进行细胞计数及计算细胞存活率，然后将葡萄糖溶液(SIGMA，储液浓度200mg/L)加入细胞液内，其浓度为1mg/L。(4)通过对纯化流程控制，得到高纯度的蛋白，具体方法为通过提高柱效和柱子体积，提高SLAMF6蛋白的收率和缩短纯化时间，1L细胞上清液中加11.688g固体NaCl至浓度为0.2mol/L，分离上清液，采用离心方法分离，在离心机转速为12000rpm条件下，离心20min，分离出的上清液用0.22μm滤器过滤除菌、除杂质，使样品充分澄清；选用GE品牌Ni Sepharose 6Fast Flow(FF)column，规格26mm*20mm，连接上AKTA Purification，正确运行系统，使用5CV(倍柱体积)的0.2mol/L的NaOH冲洗层析系统，浸泡3h进行内毒素灭活，然后用至少10CV去热源水冲洗层析系统至中性；使用5CV的控热源0.2mol/L的NiSO4充分冲洗层析系统，以活化层析介质，然后用5CV去热源水冲洗层析系统将游离的NiSO4冲洗干净；使用5CV平衡Buff 1充分冲洗层析系统，然后将预处理后的样品以5ml/min的流速进行上样，上样完成后再用5CV平衡Buff 1充分冲洗层析系统；使用3CV平衡Buff 1和洗脱Buff 1，采用步级洗脱方式(分三步：E20、E50、E500)纯化目标蛋白。取泳道4和泳道5合并，进行分子筛精细纯化，选用GE品牌Superdex 200，规格26mm*600mm，连接上AKTA Purification，正确运行系统，使用3CV的控热源水充分冲洗层析系统，将层析系统冲洗干净；使用3CV平衡缓冲液充分冲洗层析系统，然后将捕获回收的样品以2ml/min的流速进行上样，上样完成后再用3CV平衡缓冲液洗脱，根据纯化图谱接收样品馏分。进一步的，步骤(2)中，所述的高表达且含有真核筛选抗性的载体是具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的真核表达载体。进一步的，所述真核抗生素为G418、Zerocin、潮霉素、Puro和hygro中的一种，优选G418。进一步的，稳定高效表达SLAMF6蛋白的所述细胞株为HEK293细胞、CHO-DG44、RAJI和JURKAT中的一种，HEK293细胞中优选293A、293F。本专利技术的一种SLAMF6蛋白，所述SLAMF6蛋白具有完全的生物学活性，纯度大于95％，细菌内毒素小于1EU/μg。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术采用真核表达系统表达SLAMF6蛋白，提供了获得SLAMF6蛋白细胞株的方法，制备的SLAMF6蛋白具有很好的生物学活性，蛋白纯度达到95％以上，能很好的满足后续的研发需求；SLAMF6蛋白往往具有糖基化现象，根据该蛋白的特性，采用人HEK293细胞表达SLAMF6蛋白，更易获得具有生物活性的蛋白，通过真核表达载体上的抗性基因，利用合适的G418浓度进行抗性筛选，最终获得了表达SLAMF6蛋白的细胞株；本专利技术采用哺乳动物表达系统，通过对载体改造，用工程细胞HEK 293(人胚胎肾细胞)筛选出分泌表达该蛋白的细胞株，通过本专利技术制备SLAMF6蛋白，解决了原核表达SLAMF6蛋白表达差的问题，通过分泌表达克服了复性困难的的问题，同时人的细胞表达人的重组蛋白，具有更准确的糖基化，满足了研发需求；通过对现有的真核表达载体进行改造，获得高表达且具有抗性的表达载体，将SLAMF6蛋白基因克隆到改造的真核表达载体上，通过抗性筛选，获得高表达SLAMF6蛋白的细胞株，通过改变培养条件，优化纯化流程，最终得到具有完全生物学活性的高纯度SLAMF6蛋白，克服了原核表达该蛋白表达质量差，无法糖基化的缺陷。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术实施例一中SLAMF6蛋白纯化电泳图；图2是本专利技术实施例一中最终纯化得到SLAMF6蛋白的电泳图；图3是本专利技术实施例一中得到的SLAMF6蛋白活性测定数据图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下列举具体实施例进一步阐述本专利技术，应理解，实施例并非用于限制本专利技术的保护范围，实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例一1、对SLAMF6蛋白序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种SLAMF6蛋白的制备方法，其特征在于：包括将SLAMF6蛋白中基因进行序列优化的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种SLAMF6蛋白的制备方法，其特征在于：包括将SLAMF6蛋白中基因进行序列优化的步骤。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对SLAMF6蛋白中基因进行序列优化，优化后的所述SLAMF6蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(2)通过真核抗性筛选，得到表达SLAMF6蛋白的细胞株；(3)对细胞株进行培养，得到细胞株分泌物SLAMF6蛋白。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋作伟，由超，李德彬，陆欢，
申请(专利权)人：吴江近岸蛋白质科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32