本发明专利技术提供一种快速检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的ELISA检测试剂盒，包含：纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原、酶标板，兔抗虹鳟鱼IgG作为二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为酶标三抗。本发明专利技术的ELISA检测试剂盒是一种快速、特异性强、灵敏性高、检测方便、批量化使用、商品化程度高的虹鳟鱼IHNV抗体检测试剂盒。可用于虹鳟鱼IHNV抗体的检测，不与其他弹状病毒科病毒发生交叉反应，可实现批量样本的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物传染病病原微生物检测领域，尤其是涉及一种快速、准确检测虹鳟鱼传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒。
技术介绍
传染性造血器官坏死病是一种能够引起鲑鱼、鳟鱼等鲑鱼的急性传染病。是由传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)引起的，属于弹状病毒科成员。其发病特征主要以肾脏和脾脏等造血器官坏死为主，主要传播途径是患病鱼类或者是感染病毒鱼卵的进出口。该病最早流行于美国西北太平洋地区，随后传遍整个北美、亚洲和欧洲。1985年，IHNV病毒进入我国东北境内，并在辽宁本溪市大规模爆发流行。近几年，在河北、甘肃、深圳和北京等养殖场也检测到了IHNV，并给当地的冷水养殖业造成严重的经济损失。IHNV主要危害刚孵育的鱼苗到四周龄的鲑科幼鱼，感染后死亡率可达到70％-90％，目前已成为制约虹鳟鱼养殖业发展的重要威胁并被世界动物卫生组织(IEO)列为必报动物疫病，为鱼类进出口第一类检疫对象，我国列为第二类动物疫病。由于病毒病尚无有效的治疗方法，因此，病毒性疾病的早期快速检测对控制该病的爆发流行至关重要。目前，我国对于IHNV病毒的检测方法的研究相对比较落后，常用的分子生物学检测方法主要是检测病毒核酸的PCR方法。由于IHNV相应抗原的制备工艺复杂，产量低的原因，免疫学检测技术的研究尚有很大的空缺。无论是感染还是免疫监测，都需要建立一个虹鳟鱼抗体的高通量检测技术。IHNV的糖蛋白(简称G蛋白)是病毒的主要抗原，能够诱导产生中和抗体和刺激细胞免疫。此外，糖蛋白还参与病毒与细胞受体的识别和结合的过程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、特异性强、灵敏性高、使用方便可商品化的虹鳟鱼IHNV抗体检测试剂盒。可用于虹鳟鱼IHNV抗体的检测，不与其他弹状病毒科病毒发生交叉反应，可实现批量样本的检测。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种快速检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的ELISA检测试剂盒，包含：纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原、酶标板，兔抗虹鳟鱼IgG作为二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为酶标三抗。还包含：稀释液、显色液、终止液、阳性血清和/或阴性血清。本专利技术进一步提供上述作为抗原的纯化的IHNV重组G蛋白的制备方法：(1)将IHNV分离株G蛋白膜外表达区进行真核表达；(2)利用pFB-LIC-Bse杆状病毒载体以及rBacmid-G重组杆粒在sf9昆虫细胞中获得重组G蛋白；(3)纯化。步骤(1)是从传染性造血器官坏死病病毒IHNV中扩增糖蛋白G基因中1380bp的膜外表达区。用于扩增糖蛋白G基因中1380bp的膜外表达区的特异性引物的核苷酸序列优选为：F：5'-ATGGACACCATGATCACCAC-3'；R：5'-CTACCAGTGGAGT-3'。作为二抗的兔抗虹鳟鱼IgG的制备方法是：虹鳟鱼血清经纯化获得IgM后将其免疫大耳白兔，获得针对虹鳟鱼IgM的特异性抗体IgG。本专利技术继续提供使用上述试剂盒检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的方法，用纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原包被酶标板，过夜；将待检血清、二抗、三抗稀释，分别反应后进行ELISA测定。所述抗原IHNV重组G蛋白的包被浓度优选为2μg/ml，待检血清的稀释度优选为1:5。所述二抗稀释浓度优选为1:1000，三抗稀释倍数优选为1:4000。待检血清结合时间为60min，二抗结合时间为60min，三抗作用时间为30min。反应后测定OD450值，进行OD450值平均值X、标准方差S.D的计算；计算出OD450的平均值和标准方差S.D，确定阳性血清临界值为0.24，阴性血清临界值为0.206，即当被检血清样品的OD450≥0.24时，判为阳性；OD450＜0.206判为阴性。进一步说明如下：本专利技术重点涉及IHNV的G蛋白抗原的表达、纯化、免疫原性分析，虹鳟鱼血清免疫球蛋白IgM的提取和纯化，兔抗虹鳟鱼免疫球蛋白IgG的制备，建立检测IHNV病毒血清抗体的ELISA检测试剂盒。最优选的具体操作为：(1)本专利技术所用IHNV病毒株为实验室分离，根据GeneBank中登陆的IHNV基因序列(L40883)用Primer5设计引物。(2)本专利技术采用RT-PCR方法从传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)中扩增糖蛋白(G)基因中1380bp的膜外表达区，将其克隆至pFB-LIC-Bse杆状病毒载体中，构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-G，转化至感受态细胞DH10Bac中，获得重组杆粒rBacmid-G。再将其转染至sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒。IFA和Western blot分析鉴定重组G蛋白可被抗组氨酸单抗(anti-his)以及anti-IHNV鼠血清特异性识别，即IHNV G基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达。(3)本专利技术用以制备兔抗鱼二抗的血清取自虹鳟鱼IHNV阴性血清，共30ml。(4)使用GE公司预装HiTrap Protein A HP柱1mL对虹鳟鱼IHNV阴性血清进行亲和层析，目的是获得虹鳟鱼免疫球蛋白IgM。层析中所用的条件和缓冲液浓度等均经过摸索，以达到最佳效果。鱼血清用20-200ml PBS稀释，其中以100ml PBS稀释效果最佳。用0.45μm膜过滤，以0.1-1mg/ml的流速上样，其中以0.5mg/min的流速上样最优,并过夜反复循环上样。用5-50倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/L PBS,pH7.0)洗去未结合的蛋白，其中以30倍柱体积的结合缓冲液洗脱未结合的蛋白效果最佳。再用5-15倍柱体积的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH3.5)缓冲液洗脱结合的蛋白，其中以10倍柱体积的缓冲洗脱液洗脱效果最佳。用nanodrop蛋白测定系统，测定虹鳟鱼IgM浓度。本专利技术采用Bio-Rad非连续缓冲系统垂直板电泳，对纯化的虹鳟鱼IgM进行纯度分析。(5)将获得的纯化虹鳟鱼IgM免疫大耳白兔，目的是获得兔抗虹鳟鱼IgM的血清。与弗氏完全佐剂混合对大耳白兔进行初免，100μg/只，加强免疫用纯化IgM与弗氏不完全佐剂混合，100μg/只，进行3次加强免疫，在3免和4免疫后7天采血，分离血清测效价，血清效价可达到1:8000，最高达到1：32000，4次免疫后10天采血收集全部兔血清。(6)使用GE公司预装HiTrap Protein G HP柱1mL对获得的兔抗虹鳟鱼IgM的血清进行亲和层析，目的是获得兔抗虹鳟鱼免疫球蛋白IgG。兔血清用50-200ml PBS稀释，其中以100ml PBS稀释效果最佳。用0.45μm膜过滤，以0.1-1mg/ml的流速上样，其中以0.5mg/min的流速上样最优。然后用1-8倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/L PBS,pH7.0)洗去未结合的蛋白,其中以5倍柱体积的结合缓冲液效果最好。再用6倍柱体积的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH3.5)缓冲液洗脱结合的蛋白，结合蛋白以1mL管为单位分步收集到含30μL pH9.0的Tris-Cl中和液的收集管中。用nanodrop蛋白测定系统，测定兔IgG浓度。本专利技术采用Bio-Rad非连续缓冲系统垂直板电泳，对纯化的兔IgG进行纯度分析。(7)本专利技术将IHNV重组G本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含：纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原、酶标板，兔抗虹鳟鱼IgG作为二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为酶标三抗。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测虹鳟鱼血清中IHNV抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含：纯化的IHNV重组G蛋白作为抗原、酶标板，兔抗虹鳟鱼IgG作为二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为酶标三抗。2.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含：稀释液、显色液、终止液、阳性血清和/或阴性血清。3.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述纯化的IHNV重组G蛋白的制备方法是：(1)将IHNV分离株G蛋白膜外表达区进行真核表达；(2)利用pFB-LIC-Bse杆状病毒载体以及rBacmid-G重组杆粒在sf9昆虫细胞中获得重组G蛋白；(3)纯化。4.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(1)是从传染性造血器官坏死病病毒IHNV中扩增糖蛋白G基因中1380bp的膜外表达区。5.根据权利要求4所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(1)中用于扩增糖蛋白G基因中1380bp的膜外表达区的特异性引物的核苷酸序列为：F：5'-AT...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙惠玲，罗琳，马志宏，徐福洲，温书香，姜娜，李铁梁，邢薇，步卫东，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，北京市水产科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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