启动子3M1F及其应用制造技术

本发明专利技术公开了启动子3M1F及其应用。本发明专利技术提供的启动子，命名为3M1F，为序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子。本发明专利技术还保护一种DNA分子(融合基因)，自上游至下游依次包括序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子和报告基因。本发明专利技术还保护含有所述融合DNA的重组质粒。本发明专利技术还保护将所述重组质粒导入宿主菌得到的重组菌。本发明专利技术还保护所述重组菌在检测2,4,6-三硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯和/或甲苯和/或2,4-二硝基甲苯中的应用。本发明专利技术提供的生物传感器不仅可应用于战时及战后地雷等爆炸物位置的检测鉴定，还为土壤及水环境中的TNT检测提供新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及启动子3M1F及其应用。
技术介绍
2,4,6-三硝基甲苯(英文名称为2,4,6-Trinitrotoluene，简称2,4,6-TNT或TNT)是一种无色或淡黄色晶体状硝基苯爆炸物，是一种重要的化工原料，在国防工业、矿山开采、基础建设等领域均有重要作用。在炸药生产，使用企业区，以及许多战场遗址、军事训练区，TNT污染一直是主要的环境问题之一。TNT能够渗入到土壤和水系统当中，长期参与生态循环，甚至产生“粉红水”，其清理十分困难和昂贵。已有报道表明TNT对微生物、绿藻类植物和动物均有毒害作用，同时TNT及其降解物可以被引进食物链中，进而对人类健康造成严重的不良影响。短期内接触大量三硝基甲苯后，会引起急性中毒，严重者可引起呼吸衰竭而死亡。长期接触三硝基甲苯后，可引起慢性中毒，其损害的靶器官主要是肝、眼睛、血液系统及神经系统，同时造成免疫功能降低，罹患贫血和癌症的几率也会大大增加。由于TNT具有明显的毒害作用，目前基于TNT的理化性质，已经开发了许多TNT的检测技术，如高效液相色谱(HPLC)、紫外、气相色谱-质谱(GC-MS)、激光表面增强拉曼光谱(SERS)、核磁共振、离子迁移谱等方法，然而它们都需要昂贵和复杂的仪器或繁复的样品制备方法。生物传感器作为现在工程
的一个研究热点，以生物活性单元(如酶、抗体、核酸、细胞等)作为生物敏感元件与待检测的目标物相互作用后产生响应信号，信号处理元件对响应信号进行接收、加工、转换、输出，从而实现对目标物的定性、定量检测。目前，基于目标物生物活性的生物传感器技术已被广泛研究以用于一些特殊的化合物、化学基团以及一些可造成环境污染的有毒化合物的检测。常用的感应元件是参与了细胞应答的启动子区域，而在众多可选择的响应元件(通常为报告基因)中，化学发光(如luxCDABE of Photorhabdusluminescens)和荧光蛋白(如green fluorescent protein，GFP)是最为普遍的两种。当前,有大量针对重金属毒害化合物的生物传感元件的报道，例如，DNA酶(脱氧核糖酶)由于对重金属离子如Pb(II)、Cu(II)和Zn(II)具有高的特异性和灵敏性而被应用于重金属离子传感器。使用荧光基团和淬光基团标记的DNA酶与Pb(II)、Hg(II)和Cu(II)络合的功能化的DNA酶生物传感器可以将检出限降低到10nM。Liao等以钙粘蛋白为调控基因，以绿色荧光蛋白为报告基因，成功构建大肠杆菌DH5α细胞生物传感器用于土壤和沉积物中重金属的测定，可检测到0.1nmol/L的Sb(III)、Cd(Ⅱ)和10nmol/L的Pb(Ⅱ)，灵敏度高且价格便宜，在实
际样品中具有应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供启动子3M1F及其应用。本专利技术提供的启动子，来源于大肠杆菌K-12 MG1655，命名为3M1F，为序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子。本专利技术还保护序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子在启动目的基因表达中的应用。所述目的基因可为报告基因，具体可为荧光标记基因，更具体可为GFP基因。GFP基因具体可如序列表的序列2所示。所述启动目的基因表达具体可为在2,4,6-三硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯和/或甲苯和/或2,4-二硝基甲苯的诱导作用下启动目的基因表达。本专利技术还保护一种DNA分子(融合基因)，自上游至下游依次包括序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子和报告基因。所述DNA分子中，由序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子启动所述报告基因的表达。所述报告基因具体可为荧光标记基因，更具体可为GFP基因。GFP基因具体可如序列表的序列2所示。本专利技术还保护含有所述融合DNA的重组质粒。所述重组质粒具体可为在pET-24(+)载体的多克隆位点插入序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子和GFP基因得到的重组质粒，所述重组质粒中由序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子启动所述GFP基因的表达。GFP基因具体可如序列表的序列2所示。所述重组质粒具体可为在pET-24(+)载体的BglⅡ和Xba Ⅰ酶切位点之间插入序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子、BamHI和XhoI酶切位点之间插入GFP基因得到的重组质粒。本专利技术还保护将所述重组质粒导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。所述重组菌即为用于检测2,4,6-三硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯和/或甲苯和/或2,4-二硝基甲苯的生物传感器。本专利技术还保护所述重组菌在检测2,4,6-三硝基甲苯和/或2,6-二硝基甲苯和/或甲苯和/或2,4-二硝基甲苯中的应用。合成生物学是21世纪初提出的一门全新的交叉学科，2005年MIT的Endy发表了“工程生物学的基础”综述论文,明确提出在合成生物学中引入工程中常用的“标准化”、“复杂系统解藕”、“概念抽象化”做法,将合成生物学涉及的生物系统分成DNA、零件、装置、系统这样4个层次。合成生物学的研究目前主要朝两个方向发展：一是设计、建造具有生物功能的元件如生物分子或反应系统、生物装置和基因网络、多元件组成的功能单位及其更高级复杂系统的组装等。二是开发建立生物制造所需要的技术，包
括如大分子基因组合成技术，生物功能元件的分析与测试技术，生物体信息的捕获与处理技术，系统模拟与控制技术等。在此基础上合成生物学界提出了Bio-Brick思想，既构建标准，便于在活细胞体内，使用现有生物元件组合搭建新的基因线路和生命系统。本专利技术提供了自然界不存在的全新启动元件，利用本专利技术提供的启动子，按照Bio-brick思想，作为生物传感器中最为核心的检测元件，其他生物学家可以组装出各种装地雷探测的传感线路，并为新功能的基因线路和生命系统的搭建提供必备的贮备元件。本专利技术的专利技术人首先从大肠杆菌中筛选应答较为灵敏的启动元件，然后对启动元件进行随机突变并构建随机启动子文库，获得了一批可响应靶标分子TNT及其衍生物的全新启动子。本专利技术的专利技术人采用3M1F，以绿色荧光蛋白为报告基因，构建了以大肠杆菌为底盘的全细胞生物传感器，并在检测中体现出了良好的特异性和灵敏度，为后期生物传感器更深层次的开发提供了良好的元件储备。本专利技术提供的生物传感器不仅可应用于战时及战后地雷等爆炸物位置的检测鉴定，还为土壤及水环境中的TNT检测提供新的方法。附图说明图1为实施例3的结果。图2为实施例4的结果。图3为实施例5中3M1F的EC200值。图4为实施例5中对照片段的EC200值。图5为实施例6的结果。图6为实施例7的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所有统计学分析均采用SPSS 18.0统计学软件。pET24-GFP载体：将序列表的序列2所示的GFP基因插入pET本文档来自技高网...

【技术保护点】
序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子。2.序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子在启动目的基因表达中的应用。3.一种DNA分子，自上游至下游依次包括序列表的序列1自5’末端第7至93位核苷酸所示的DNA分子和报告基因。4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：所述报告基因为荧光标记基因。5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于：所述荧光标记基因为GFP基因。6.含有权利要求3至5中任一所述DNA分子的重组质粒。7.如权利要求6所述的重组质粒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，谭俊杰，阚乃鹏，陈惠鹏，王微，凌静怡，曲国龙，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11