海鲜产品检测试剂盒、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公布了一种海鲜产品检测试剂盒、其制备方法及应用。该试剂盒包括：试纸条，包括过滤垫、样本垫和检测垫等，该检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线分别包含有第一、第二抗体；以及，免疫纳米银金核壳颗粒，包含接枝功能性高分子的纳米银金核壳纳米颗粒和与功能性高分子共价结合的第三抗体，其中第一抗体仅在有目标物存在时与目标物及第三抗体以夹心方式特异性结合，而第二抗体无论目标物存在与否都与第三抗体结合。藉由本发明专利技术的试剂盒及检测方法，可以大幅提高对海鲜产品中常见食源性致病菌(特别是副溶血性弧菌)的检测范围和灵敏度，且操作简单、检测时间短，为海鲜产品的大批量、快速检测提供了有利的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种试剂盒，特别涉及一种可应用于检测海鲜产品中食源性致病菌，例如副溶血性弧菌的试剂盒、其制备方法和应用，属于微生物检测领域。
技术介绍
副溶血性弧菌是常见的食源性致病菌之一，该菌主要来源于虾、鱼和贝类等海产品。据国家食源性疾病监测网报告，至1998年以来我国由副溶血性弧菌引起的食物中毒呈上升趋势，且超过沙门菌食物中毒而跃居首位，成为最严重的食源性病原菌。人类食用该菌感染的海产品可引发肠胃炎和败血症等肠胃疾病，是我国部分沿海地区的食物中毒案例中的首要病原菌。自1950年发现副溶血性弧菌至今，国内外检测该菌的方法仍以常规分离培养法为主。该法操作复杂、检测周期长(4-7d)，已不能适应卫生应急检测的需要。因此它是必须的建立快速、灵敏的检测方法。近年来，胶体金免疫层析技术以其操作简单、快速、准确、廉价等特点而得到迅速推广，成为基层快速筛查的重要手段。但胶体金试纸条的检测灵敏度相对不高(通常高于104CFU/mL)，在检测低灵敏度要求的物质(欧盟规定副溶血性性弧菌不得检出)时，该方法的应用就受到限制。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的主要目的在于提供一种具有灵敏度高、稳定性好的海鲜产品检测试剂盒、其制备方法及应用。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：在本专利技术的一个实施方案之中提供了一种海鲜产品检测试剂盒，其包括：试纸条，包括过滤垫、样本垫和检测垫，所述样本垫的边缘部分别与过滤垫和检测垫相互接触或重合，所述检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线分别包含有第一抗体和第二抗体；以及，免疫纳米银金核壳颗粒，包含接枝功能性高分子的纳米银金核壳纳米颗粒以及与所述功能性高分子共价结合的第三抗体，所述纳米银金核壳纳米颗粒包含纳米银核和包裹纳米银核的纳米金壳层；其中，所述第一抗体仅在有目标物存在的情况下才能与目标物及第三抗体以夹心方式特异性结合，而所述第二抗体无论在有或无目标物存在的情况下均能与第三抗体特异性结合。进一步的，所述目标物至少选自食源性致病菌，所述食源性致病菌包括副溶血性弧菌。相应的，在一较为具体的实施方案之中提供了一种副溶血性弧菌检测试剂盒，其包括：试纸条，包括过滤垫、样本垫和检测垫等，所述检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线；以及，免疫纳米银金核壳颗粒；其中，所述检测线含有目标物免疫获得的捕获抗体，其仅在有目标物存在的情况下才能与目标物及免疫纳米银金核壳颗粒所含的目标物免疫的单抗以夹心方式特异性结合，而所述质控线含有无论在有或无目标物存在的情况下均能与所述目标物免疫的单抗特异性结合的二抗。在一更为具体的实施案例之中，所述第一抗体为副溶血性弧菌免疫得到的兔多抗，所述第二抗体为驴抗鼠二抗，所述第三抗体为副溶血性弧菌免疫得到的鼠单抗。在一些实施方案之中，所述试纸条包括依次设置的过滤垫、样本垫、检测垫和吸水垫，所述检测垫与吸水垫的边缘部相互接触或重合。在一些实施方案之中，所述试纸条可基于PVC底板而形成，即，所述试纸条包含依次分布于PVC底板上的过滤垫、样本垫、检测垫和吸水垫(亦可称为吸水纸)。其中，所述过滤垫用于过滤样品基质，消除基质干扰对实验结果的影响。其中，所述样本垫用于对待检测样品和免疫银金核壳颗粒的传输以及对样品pH环境的调节。其中，所述吸水纸用于吸收多余的免疫银金核壳颗粒以及未参加反应的液体样品。其中，所述过滤垫、样本垫、检测垫和吸水垫可采用任何合适的材料。例如，所述过滤垫可采用聚酯膜，所述样品垫可采用玻璃纤维膜，而所述检测垫可采用硝酸纤维膜。在一些实施方案之中，所述功能性高分子可选自一端具有巯基，另一端具有羧基的高分子，例如巯基化的PAA(聚丙烯酸)。在一些尤为优选的实施案例之中，所述纳米银金核壳颗粒的粒径为15-200nm，其中Ag与Au的摩尔比为1-100:1。在本专利技术的一个实施方案之中还提供了一种制备所述试剂盒的方法，其包括：提供试纸条，包括：至少取样本垫、检测垫、吸水垫依次设置，并使样本垫的边缘部与过滤垫及检测垫相互接触或重合，将第一抗体和第二抗体分别施加至检测垫上，形成彼此不重合的检测线和质控线；以及，提供免疫纳米银金核壳颗粒，包括：制备银纳米粒子，取所述银纳米粒子、柠檬酸钠及HAuCl4水溶液均匀混合反应，获得纳米银金核壳纳米颗粒，以功能性高分子修饰所述纳米银金核壳纳米颗粒后，再与第三抗体充分混合反应，并以BSA或者酪蛋白封闭，之后除去未标记的第三抗体。在一些更为具体的实施方案之中，所述制备方法可以包括：取HAuCl4水溶液在120-130℃恒温回流加热，待温度恒定后，加入银纳米粒子和柠檬酸钠溶液进行反应，获得纳米银金核壳颗粒。其中，通过调节HAuCl4和柠檬酸钠的添加量等可以得到不同粒径、不同金银含量的纳米银金核壳纳米颗粒。在一实施案例中，可以取0.1w/v％HAuCl4水溶液在120-130℃恒温回流加热，待温度恒定后，加入银纳米粒子分散液和1w/v％柠檬酸钠溶液，其中HAuCl4水溶液、银纳米粒子分散液和柠檬酸钠溶液的体积比为25:10:1，反应30min，获得纳米银金核壳颗粒。前述银纳米粒子可采用业界所知的任何合适方式制备。例如，在一实施案例之中，银纳米粒子的制备工艺可以包括：取柠檬酸三钠溶液和单宁酸溶液在240-250℃恒温回流加热，沸腾后加入AgNO3水溶液，当溶液颜色稳定后，停止加热，获得银纳米粒子。其中，通过调控单宁酸溶液的浓度等，可以调控所获银纳米粒子的粒径等。在一些实施例之中，可以将所获纳米银金核壳纳米颗粒接枝功能性高分子并与副溶血性弧菌鼠单抗混合搅拌，用BSA或者酪蛋白封闭，离心除去未结合的抗体，用复溶液复溶，备用。而对于前述试纸条，其也可以采用业界所知的任何合适方式制备，例如，可以将过滤垫、样本垫、检测垫、吸水垫依次粘贴在PVC底板上，并将第一抗体和第二抗体分别喷加到检测
垫上，形成检测线和和质控线。在本专利技术的一个实施方案之中还提供了一种检测系统，其包括：前述的任一种试剂盒，以及，检测设备，用以监测在所述试纸条上施加待检样品与免疫纳米银金核壳颗粒的混合物前后，于所述试纸条的质控线和检测线处的信号变化情况，从而实现对待检样品中目标物的定性和/或定量判断。其中，所述检测设备包括试纸条读取仪。在一些实施方案之中，本专利技术提供了一种副溶血性弧菌检测系统，包括前述的副溶血性弧菌检测试剂盒以及试纸条读取仪。在本专利技术的一个实施方案之中还提供了一种检测方法，其包括：提供前述的任一种试剂盒，将液态的待检样品与免疫纳米银金核壳颗粒混合后，再施加至所述试纸条上，以及，以裸眼判读和/或试纸条读取仪检测作为检测手段，对样品内的目标物进行定性和/或定量判断。在一些实施案例之中，所述检测方法具体可包括：将免疫纳米银金核壳颗粒与液态的待检样品充分混合后，再滴加到试纸条的样本垫上，经设定时间后，通过裸眼观察试纸条上检测线和质控线的颜色变化，定性分析待检样品中是否存在目标物，或者以试纸条读取仪记录T、C值和T/C值，并与预先建立的标准曲线对照，从而定量检测待检样品中目标物的含量。显然的，前述标准曲线可通过业界悉知的方式建立，例如，可以通过下列方法获得，即：制备一系列不同浓度的目标物，例如食源性致病菌的标准样品，依照前述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海鲜产品检测试剂盒，包括：试纸条，包括过滤垫、样本垫和检测垫，所述样本垫的边缘部分别与过滤垫和检测垫相互接触或重合，所述检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线分别包含有第一抗体和第二抗体；其特征在于所述试剂盒还包括：免疫纳米银金核壳颗粒，包含接枝功能性高分子的纳米银金核壳纳米颗粒以及与所述功能性高分子共价结合的第三抗体，所述纳米银金核壳纳米颗粒包含纳米银核和包裹纳米银核的纳米金壳层；其中，所述第一抗体仅在有目标物存在的情况下才能与目标物及第三抗体以夹心方式特异性结合，而所述第二抗体无论在有或无目标物存在的情况下均能与第三抗体特异性结合。

【技术特征摘要】
1.一种海鲜产品检测试剂盒，包括：试纸条，包括过滤垫、样本垫和检测垫，所述样本垫的边缘部分别与过滤垫和检测垫相互接触或重合，所述检测垫上分布有彼此不重合的检测线和质控线，所述检测线和质控线分别包含有第一抗体和第二抗体；其特征在于所述试剂盒还包括：免疫纳米银金核壳颗粒，包含接枝功能性高分子的纳米银金核壳纳米颗粒以及与所述功能性高分子共价结合的第三抗体，所述纳米银金核壳纳米颗粒包含纳米银核和包裹纳米银核的纳米金壳层；其中，所述第一抗体仅在有目标物存在的情况下才能与目标物及第三抗体以夹心方式特异性结合，而所述第二抗体无论在有或无目标物存在的情况下均能与第三抗体特异性结合。2.根据权利要求1所述的海鲜产品检测试剂盒，其特征在于所述纳米银金核壳颗粒的粒径为15-200nm，其中Ag与Au的摩尔比为1-100:1。3.根据权利要求1所述的海鲜产品检测试剂盒，其特征在于所述功能性高分子采用一端具有巯基，另一端具有羧基的高分子。4.根据权利要求1所述的海鲜产品检测试剂盒，其特征在于所述目标物至少选自食源性致病菌，所述食源性致病菌包括副溶血性弧菌。5.根据权利要求1所述的海鲜产品检测试剂盒，其特征在于所述第一抗体为副溶血性弧菌免疫得到的兔多抗，所述第二抗体为驴抗鼠二抗，所述第三抗体为副溶血性弧菌免疫得到的鼠单抗。6.根据权利要求1所述的海鲜产品检测试剂盒，其特征在于所述试纸条包括依次设置的过滤垫、样本垫、检测垫和吸水垫，所述检测垫与吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄又举，陈涛，赖卫华，王景云，
申请(专利权)人：中国科学院宁波材料技术与工程研究所，南昌大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33