体外培养造血干/前驱细胞的方法及其组成物技术

本发明专利技术公开了一种体外培养造血干/前驱细胞的方法及其医药组成物。本发明专利技术的制备方法特征在于，包含将以梯度离心纯化得到的单核球细胞先经过隔夜培养后，再进行造血干/前驱细胞纯化及体外放大培养。经由本发明专利技术方法制得的高纯化造血干/前驱细胞，不仅含有高比例临床上的有效造血干/前驱细胞(CD34+CD38-细胞)，同时再经冷冻保存及解冻后仍可维持有效细胞的活性及存活率。另一方面，本发明专利技术的制造方法过程中并未使用含动物来源成分的试剂，因此所得的造血干/前驱细胞培养物可直接施用于临床应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高度纯化并可立即使用的体外放大培养造血干/前驱细胞的制备方法及其组成物。本专利技术尤其涉及一种将利用梯度离心纯化所得的单核球细胞先经过隔夜培养后，再进行造血干/前驱细胞纯化及体外放大培养的方法。经由本专利技术方法制得的高纯化造血干/前驱细胞，不仅含有高比例临床上的有效造血干/前驱细胞(CD34+CD38-细胞)，且于其纯化及制造过程中并未使用含动物来源成分的试剂，因此所得的造血干/前驱细胞培养物可直接施用于临床应用。
技术介绍
造血干细胞(Hematopoietic stem cells；HSCs)系所有成熟血球的前身，具有自我更新与分化成不同造血细胞系的能力(Blood,Vol.89,No.12,1997:pp4337-4347)。迄今，造血干细胞移植(Hematopoietic stem cells transplantation；HSCT)已为广泛应用于血液疾病与先天性遗传疾病等治疗。一般而言，于临床上较合适的造血干细胞来源包含：骨髓(Bone marrow)、外围血(Peripheral blood)以及脐带血(Umbilical cord blood)。早期的骨髓干细胞抽取方式常伴随极度疼痛不适的步骤，逐渐以外围血作为造血干细胞移植的来源，但因配对不易，故近年来常以脐带血作为造血干细胞移植的来源选择。CD34是一种表现于人类造血干细胞的表面抗原，通常被作为造血干细胞的指标，临床上已有研究证明：移植细胞表面表现CD34阳性细胞(CD34+细胞)数量的多寡与移植后存活率和成功率成正比(Moore KA,et al.B1ood.1997；89:4337-4347)。随着研究进一步发现，于细胞表面表现CD34而未带有CD38抗原的细胞(CD34+CD38-细胞)才是真正有效用的造血干细胞。虽说脐带血造血干细胞移植在临床应用上已有良好成效，但在临床上,造血干细胞的数量有核细胞(Total nuclear cells；TNC)至少需达到2x107cells/kg,或者是CD34+细胞需达到2x105cells/kg以上才具有较好的移植成效。而所遇
到的课题为：脐带血所能取得的造血干细胞数量极有限，因此，已有许多致力于造血干细胞体外扩增放大的技术研究。举例而言，美国专利申请号US11/255,191公开了一种提供造血干细胞体外扩增及其分析方法，利用加入各种有效含量的细胞激素培养造血干细胞，并提供一用于鉴定分离造血干细胞的试剂盒；日本专利申请号JP2012050357为造血干细胞的制造方法，则利用添加一扩增试剂至培养基中以放大造血干细胞数；以及，中国专利申请号CN2012100087227提供一种以血管内皮细胞靶向的Notch配体的可溶性融合蛋白人D111-RGD(hD111-RGD)体外扩增造血干细胞的方法。另，除了于培养阶段促进造血干细胞增生以增其数量外，中国台湾专利申请号第098115726号，公开了用于分离、体外扩增及收获造血干细胞的方法与系统，系可快速分离出造血干细胞并进行体外扩增以提高造血干细胞获取效率。目前已知的体外扩增造血干细胞的方法，主要于培养基中添加各种不同物质，如细胞激素、化合物及重组蛋白等来促使造血干细胞增生。然而，大部分造血干细胞的培养时间需长达7天甚至于2周以上，并无法在短期间内获取临床上有效的造血干细胞(CD34+CD38-细胞)族群。由于造血干细胞的来源极其珍贵且脆弱，因此如何于有效提升造血干细胞的回收率与产率，以及如何将获取不易的造血干细胞作有效保存，成为体外扩增造血干细胞的核心关键。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的一方面在于提供一种体外培养造血干/前驱细胞的方法。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种体外培养造血干/前驱细胞的方法，包括：将含有造血干/前驱细胞的来源血液解冻，以梯度离心进行单核球纯化，获取高纯度单核球细胞；将前述高纯度单核球细胞进行隔夜培养，之后分离造血干/前驱细胞；将自前述经隔夜培养的单核球细胞分离所得的高纯度造血干/前驱细胞培养于含有细胞激素、TAT-HOXB4蛋白质及5％人类血清(Human AB serum；HABS)的伊思柯夫改良培养液(Iscove's modified Dulbecco's medium；IMDM)中培养
4-7天；及收取造血干/前驱细胞培养物。其中该造血干/前驱细胞的来血液为源血液为外围血(Peripheral blood)或脐带血(Umbilical cord blood)。于本专利技术的一项具体实施例，系将高纯度造血干/前驱细胞以细胞密度/1x104-5x105cells/mL培养于含有细胞激素、TAT-HOXB4蛋白质及5％人类血清的伊思柯夫改良培养液中培养4-7天，之后收取造血干/前驱细胞培养物。于本专利技术的另一项具体实施例，所述的细胞激素包含间白素-3(IL-3)、间白素-6(IL-6)、干细胞因子(SCF)、FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT-3L)及血小板生成素(TPO)。另一方面，本专利技术体外培养造血干/前驱细胞的方法进一步包含：将所得的体外培养造血干/前驱细胞以含有24-80％的人体血清白蛋白25％注射液及20％的二甲基亚砜和右旋糖酐细胞冻存混合液(内含6-20％人类白蛋白)的保存剂进行冷冻保存。本专利技术以传统密度梯度离心纯化单核球细胞后，透过隔夜培养使单核球细胞活性恢复，进而于隔日纯化造血干/前驱细胞，藉以大幅提高造血干/前驱细胞的回收率。又另一方面，本专利技术的专利技术目的在于提供一种根据本专利技术的制备法所制得的组成物。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种造血干/前驱细胞组成物，包括临床上有效造血干/前驱细胞(CD34+CD38-细胞)的百分比例为15-40％；于本专利技术的一具体较佳实施例，其百分比例为25-30％。且所述临床上有效造血干/前驱细胞(CD34+CD38-细胞)的比例与未经体外培养的造血干/前驱细胞族群比较可提高3-5倍。于本专利技术的另一较佳具体实施例，所制得的组成物中临床上有效造血干/前驱系胞(CD34+CD38-细胞)的百分比可高达27％，且相较于未经体外培养的造血干/前驱细胞族群，可提高3.8倍。附图说明图1为利用流式细胞仪分析以不同纯化步骤的造血干/前驱细胞的回收率图。图2(A)为有核细胞总数(Total nuclear cell,TNC)扩增倍率；图2(B)为CD34+细胞数量扩增倍率图。图3为利用流式细胞仪分析以不同成分的细胞培养液及不同细胞密度条件培养下所增生的造血干/前驱细胞族群比例的比较图。图4(A)为有核细胞总数(Total nuclear cell,TNC)扩增倍率图；图4(B)为CD34+细胞数量扩增倍率图。图5(A)为细胞存活率分析图；图5(B)为利用流式细胞仪分析造血干/前驱细胞族群比例图。具体实施方式本专利技术的其他特色及优点将于下列实施例中为进一步举例说明，但该实施例仅为辅助，并非用于限制本专利技术的范围。实施例一、造血干/前驱细胞的纯化及回收本专利技术的一方面特征点在于，透过纯化及隔夜培养单核球细胞，藉以提高造血干/前驱细胞的回收率。因此于本实施例所进行的实验分为两个处理组，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外培养造血干/前驱细胞的方法，其特征在于包括：将含有造血干/前驱细胞的来源血液解冻，以梯度离心进行单核球纯化，获取高纯度单核球细胞；将前述高纯度单核球细胞进行隔夜培养，之后分离造血干/前驱细胞；将自前述经隔夜培养的单核球细胞分离所得的高纯度造血干/前驱细胞培养于含有细胞激素、TAT‑HOXB4蛋白质及5％人类血清的伊思柯夫改良培养液中培养4‑7天；及收取造血干/前驱细胞培养物。

【技术特征摘要】
2015.04.16 TW 1041121781.一种体外培养造血干/前驱细胞的方法，其特征在于包括：将含有造血干/前驱细胞的来源血液解冻，以梯度离心进行单核球纯化，获取高纯度单核球细胞；将前述高纯度单核球细胞进行隔夜培养，之后分离造血干/前驱细胞；将自前述经隔夜培养的单核球细胞分离所得的高纯度造血干/前驱细胞培养于含有细胞激素、TAT-HOXB4蛋白质及5％人类血清的伊思柯夫改良培养液中培养4-7天；及收取造血干/前驱细胞培养物。2.根据权利要求1所述的体外培养造血干/前驱细胞的方法，其特征在于还包括将制备得的体外培养造血干/前驱细胞以含有24-80％的人体血清白蛋白、25％注射液及20％二甲基亚砜和右旋糖酐细胞冻存混合液保存剂进行冷冻保存。3.根据权利要求1所述的体外培养造血干/前驱细胞的方法，其特征在于，所述隔夜培养系将单核球细胞以细胞密度5x105～6x106细胞数/毫升培养于含5％人类血清的伊思柯夫改良培养液中16～18小时。4.根据权利要求1所述的体外培养造血干/前驱细胞的方法，其特征在于，所述细胞激素包括间白素-3、间白素-6、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体及血小板生成素。5.根据权利要求4所述的体外培养造血干/前驱细胞的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄济鸿，刘亭匀，陈钰霖，
申请(专利权)人：台湾尖端先进生技医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71