在不同的宫颈病变中的HR-HPV的诊断转录物和剪接模式制造技术

本发明专利技术涉及在不同的宫颈病变中的HR‑HPV的诊断转录物和剪接模式。本发明专利技术还涉及一种用于在具有HR‑HPV的受试者中区分HR‑HPV感染的严重形式和HR‑HPV感染的轻度形式的方法。本发明专利技术另外涉及包含探针寡核苷酸混合物的组合物、与本发明专利技术的方法结合使用的装置和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2011年4月28日的中国专利申请201180021993.5“在不同的宫颈病变中的HR-HPV的诊断转录物和剪接模式”的分案申请。
本专利技术涉及在具有高危(HR)-HPV的受试者中区分HR-HPV感染的严重形式和HR-HPV感染的轻度形式的方法。另外涉及包含探针寡核苷酸混合物的组合物、与本专利技术的方法结合使用的装置和试剂盒。
技术介绍
子宫颈癌(CxCa)是全世界女性的第二最常见的恶性肿瘤，由高危的人乳头状瘤病毒造成，在所述病毒中，HPV16是最流行的类型。在发达国家，常规的细胞学筛选程序已经大幅降低了这类癌症的发病率。但是，这些细胞学筛选程序具有一些缺点。宫颈刮片检查（Papanicolaou test）也经常称作巴氏试验（Pap test），是一种用于检测子宫颈的恶化前和恶性病变的诊断方法。就宫颈刮片检查而言，从宫颈获得样品，并通过光学显微术筛选指示恶性或恶化前细胞的细胞形态学变化。然后，根据观察到的病变的严重性，将样品分类。但是，通过宫颈细胞学进行诊断是一种主观方法，且性质取决于提供服务的实验室的标准。这样，病变分类仅仅是中等可再现的，且具有比阴道镜检查更差的灵敏度(Baldwin, P., R. Laskey,和N. Coleman. 2003. Translational approaches to improving cervical screening. Nat Rev Cancer 3:217-26)。此外，假阳性结果会导致大量患者被过度治疗。在近二十年中，开发了多种新的HPV诊断试验。这些方法是基于病毒、分子和生化标志物（诸如HPV蛋白、DNA和RNA）的检测。FDA批准的Hybrid Capture II试验系统(HC2) (以前的美国的Digene Corp.，现在的荷兰的Qiagen)被认为是在临床实践中检测HPV DNA的黄金标准，但是，它显示出几个缺点：a)没有进行基因分型，而是将HPV感染唯一地归于“低危”或“高危”组，b)不能鉴别多重感染，c)就HPV检测而言，不如基于PCR的方法敏感(Birner等人2001. Mod. Pathol. 14:702-709)，和d)就宫颈初癌和癌症风险的预测而言，是中等特异性的。它用于临床目的的一些非特异性可以归因于与非致癌的HPV基因型的交叉反应性(Castle, P. E., D. Solomon, C. M. Wheeler, P. E. Gravitt, S. Wacholder,和M. Schiffman. 2008. Human papillomavirus genotype specificity of hybrid capture 2. J Clin Microbiol 46:2595-604)。此外，它仅仅允许评估受试者是否被HPV感染。所述试验不允许评估HPV感染的严重性。因而，一旦已经诊断出HPV，需要进一步检查。在近几年中开发了几种基于PCR的方法，它们允许更精确地检测HPV感染。这些PCR系统中的大多数使用通用引物或普通引物，所述引物结合HPV基因组中的高保守区，例如在L1区域中。然后对扩增的PCR产物进行进一步分析(例如测序、限制性片断长度多态性(RFLP)分析或杂交)，以便鉴别特异性的粘膜的HPV基因型。纵向定群调查已经证实，与单独的细胞学试验相比，组合的Pap和HPV试验会表现出更好的灵敏度，并预测更好的针对CIN3的长期保护(在具有两个试验的正常结果的女性中) (Bulkmans, N. W., J. Berkhof, L. Rozendaal, F. J. van Kemenade, A. J. Boeke, S. Bulk, F. J. Voorhorst, R. H. Verheijen, K. van Groningen, M. E. Boon, W. Ruitinga, M. van Ballegooijen, P. J. Snijders,和C. J. Meijer. 2007. Human papillomavirus DNA testing for the detection of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 and cancer: 5-year follow-up of a randomised controlled implementation trial. Lancet 370:1764-72, Hoyer, H., C. Scheungraber, R. Kuehne-Heid, K. Teller, C. Greinke, S. Leistritz, B. Ludwig, M. Durst,和A. Schneider. 2005. Cumulative 5-year diagnoses of CIN2, CIN3 or cervical cancer after concurrent high-risk HPV and cytology testing in a primary screening setting. Int J Cancer 116:136-43)。但是，HPV PCR试验的高灵敏度也导致临床上不相关的感染或退化病变的鉴别。因此，在单个高危HPV DNA阳性结果以后，晚期病变的存在或宫颈癌的发展的阳性预测值(PPV)较低。得到的高比例的试验阳性的、但是疾病阴性的诊断，会造成过度治疗、额外费用和涉及的女性的非常焦虑(International Agency for Research on Cancer. 2005. Cervix Cancer Screening. IARC Press, Lyon)。不同于HPV DNA试验，RNA检测允许鉴别和分析转录活性的病毒。最近对用于宫颈涂片（其除了保存DNA和细胞形态以外，还保存RNA）的保存介质的介绍，促进了RNA检测方法的发展。迄今为止，已经介绍了2种商业的HPV RNA检测试验：i)来自Biomérieux (以前的NorChip)的PreTect HPV Proofer®，其检测靶向来自HR-HPV 16、18、31、33和45型的E6和E7序列(E6/E7)的早期全长mRNA，和ii) Aptima®HPV试验，来自GenProbe的一种广谱E6/E7全长mRNA扩增方法。来自这些试验的有限数据指示，全长HPV E6/E7 mRNA（而不是单独的HPV DNA）的检测，仅仅轻微增加宫颈癌和它的前体的开发的PPV，与此同时，灵敏度降低，因而阴性预测值(NPV)降低(Cuschieri, K. S., M. J. Whitley,和H. A. Cubie. 2004. Human papillomavirus type specific DNA and RNA persistence--implications for cervical disease progression and monitoring. J Med Virol 73:65-70)。这些技术的主要缺点涉及下述事实：由于仅定性测量单一全长病毒癌基因转本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于测定E1C的基因产物的存在和/或量的检测剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于在具有HR‑HPV的受试者中区分(i) HR‑HPV感染的严重形式和(ii) HR‑HPV感染的轻度形式，所述受试者不包含整合形式的HR‑HPV基因组，所述区分是通过包括下述步骤的方法：a)在所述受试者的样品中，测定E1C的基因产物的存在或缺失，和b)区分(i) HR‑HPV感染的严重形式和(ii) HR‑HPV感染的轻度形式，其中E1C的基因产物是E1的剪接转录物，其中所述HR‑HPV和对应的E1剪接转录物是i) HPV33和包含894^2702连接点的剪接转录物，ii) HPV35和包含883^2649连接点的剪接转录物，iii) HPV52和包含879^2696连接点的剪接转录物，或iv) HPV58和包含898^2706连接点的剪接转录物，或其中E1C的基因产物是细胞从所述E1的剪接转录物翻译出的多肽。

【技术特征摘要】
2010.05.05 US 61/3315611.用于测定E1C的基因产物的存在和/或量的检测剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于在具有HR-HPV的受试者中区分(i) HR-HPV感染的严重形式和(ii) HR-HPV感染的轻度形式，所述受试者不包含整合形式的HR-HPV基因组，所述区分是通过包括下述步骤的方法：a)在所述受试者的样品中，测定E1C的基因产物的存在或缺失，和b)区分(i) HR-HPV感染的严重形式和(ii) HR-HPV感染的轻度形式，其中E1C的基因产物是E1的剪接转录物，其中所述HR-HPV和对应的E1剪接转录物是i) HPV33和包含894^2702连接点的剪接转录物，ii) HPV35和包含883^2649连接点的剪接转录物，iii) HPV52和包含879^2696连接点的剪接转录物，或iv) HPV58和包含898^2706连接点的剪接转录物，或其中E1C的基因产物是细胞从所述E1的剪接转录物翻译出的多肽。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述转录物的存在或缺失的测定包括下述步骤：如果所述转录物存在，则用特异性地扩增所述转录物的寡核苷酸扩增所述转录物，并测定如此扩增的转录物的量。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述E1C的基因产物的存在指示HR-HPV感染的严重形式。4.根据权利要求1所述的用途，其中所述E1C的基因产物的缺失指示HR-HPV感染的轻度形式。5.根据权利要求1所述的方法，其中a) HR-HPV是HPV33，且其中E1C的基因产物是包含894^2702连接点的转录物，或b) HR-HPV是HPV35，且其中E1C的基因产物是包含883^2649连接点的转录物。6.根据权利要求1所述的用途，其中测定E1C的剪接转录物的存在或缺失包括：PCR扩增所述E1C的剪接转录物。7.根据权利要求6所述的用途，其中PCR扩增使用引物的混合物。8.根据权利要求1所述的用途，其中使用特异性地检测所述转录物的探针寡核苷酸，测定所述转录物的存在。9.根据权利要求1所述的用途，其中所述方法包括下述额外步骤：评估在所述受试者的所述样品中的HR-HPV基因组的整合状态。10.用于测定第一基因产物的存在和/或量的检测剂和用于测定第二基因产物的存在和/或量的检测剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于在具有HR-HPV的受试者中区分(i) HR-HPV感染的严重形式和(ii) HR-HPV感染的轻度形式，所述区分是通过包括下述步骤的方法：a)测定在所述受试者的样品中的第一种基因产物的量，所述第一种基因产物是E1C的基因产物，b)测定所述样品中第二种基因产物的量，c)计算在步骤a)中测得的所述第一种基因产物的量与在步骤b)中测得的所述第二种基因产物的量之比例，d)将在步骤c)中计算出的比例与参照比例进行对比，和e)区分(i) HR-HPV感染的严重形式和(ii) HR-HPV感染的轻度形式，其中所述第一种基因产物是E1C的剪接转录物，且其中所述第二种基因产物是选自下述的转录物：E6*I的转录物、E1^E4的转录物、Apm1的转录物、Ubc的转录物、U1A的转录物、E1的转录物、E5的转录物和L1的转录物，其中所述HR-HPV和对应的E1C的剪接转录物是i) HPV33和包含894^2702连接点的剪接转录物，ii) HPV35和包含883^2649连接点的剪接转录物，iii) HPV52和包含879^2696连接点的剪接转录物，或iv) HPV58和包含898^2706连接点的剪接转录物，或其中所述第一种基因产物是从E1C的剪接转录物翻译出的第一种多肽，且所述第二种基因产物是从选自下述的转录物翻译出的第二种多肽：E6*I的转录物、E1^E4的转录物、Apm1的转录物、Ubc的转录物、U1A的转录物、E1的转录物、E5的转录物和L1的转录物，且其中分别使用特异性地检测所述第一种和所述第二种多肽的抗体，测定所述第一种多肽的量和所述第二种多肽的量。11.根据权利要求10所述的用途，其中计算所述第一种基因产物的量与所述第二种基...

【专利技术属性】
技术研发人员：M施密特，L吉斯曼，M帕夫利塔，D赫夫勒，
申请(专利权)人：德国癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：德国;DE