本发明专利技术公开了猫嵌杯病毒CH‑JL5株及猫嵌杯病毒CH‑JL5株灭活疫苗，灭活疫苗采用皮下注射，免疫接种操作方便。实验结果表时所述灭活疫苗不会引起FCV毒力增强或导致基因整合，也不会引起猫结膜炎、鼻炎、口腔溃疡或急性死亡，安全无副作用。实验表明，所述猫嵌杯病毒灭活疫苗能诱导猫产生良好的体液免疫和细胞免疫，采用FCV CH‑SH株进行攻毒试验，免疫保护率为96%；采用FCV 2080株进行攻毒试验，免疫保护率为100%；采用FCV USDA株进行攻毒试验，免疫保护率为100%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学及免疫学领域，具体涉及猫嵌杯病毒CH-JL5株和猫嵌杯病毒CH-JL5株灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
猫嵌杯病毒（Feline calicivirus，FCV），是一种能够引起猫和所有猫科动物口腔及上呼吸道疾病的病原，是一种多发性、流行性、具有高度传染性的病原，所引起的疾病我们称之为猫传染性-鼻结膜炎。FCV是一种很容易发生变异的一种病毒，不同毒株之间因为变异毒株的存在，其毒力针对不同动物体质其致病力也不同，在临床上，所表现的症状也不一样。单独的FCV感染不会引起猫和猫科动物的死亡，常常和细菌、衣原体、支原体、寄生虫以及其他猫科上呼吸道病毒发生混合感染，这也是导致该病死亡率增高的原因之一。近年来，更是频频出现了高致死性变异强毒株，在意大利、法国和英国已有报道，更有狗感染的病例报道。该病毒在世界各地均被分离得到，最早在1957年，该病毒由Fastier等人第一次在猫科动物身上分离出来；Kadoi也从非洲地区的狮子和老虎的口腔和鼻腔分离出该病毒；在1997年，王祥生、夏咸柱等在我国广西一动物园病死的2只大虎和4只小虎体内成功分离到该病毒；2002年，高玉伟等人在我国上海地区动物园老虎和猎豹的口腔以及分泌物中成功分离到两株病毒。由此可见，该病很久以来一直在全世界各个地区感染着猫科动物，不仅对猫造成一定的危害，对野生保护动物的侵袭更不容忽视，应引起我们的重视。FCV对猫的感染十分常见，无论是私人养的宠物猫还是在外流浪的野猫。目前，私人宠物猫的圈养条件、宠物医院的卫生条件差、宠物猫与宠物猫的私自接触以及畜主之间的接触都会造成病毒的传播，导致发病和带毒现象。流浪猫的带毒现象也十分普遍，流浪猫相互之间及彼此与食物间的接触，都会造成该病的发生。1岁以下年龄的猫均为易感群体，一般5-85日龄的猫最易发生感染，56-84日龄的猫发病居多，潜伏期为1-7d不等，发病后多数体温升高，可达39.5-40.5℃。引起的上呼吸道症状主要包括咳嗽、流涎、牙龈炎、眼周炎和口腔溃疡，严重时表现跛行、胃肠炎、肺炎等。发病和患病的动物为该病毒的主要传染源，病毒在干燥环境下可存活数周，在寒冷潮湿条件下，由于不同毒株其存活的时间也不同，高密度的圈舍饲养在一定程度上提高了健康动物的感染率。患病动物接触过的用具、笼舍、排出的废物和分泌物都可以直接或间接地传染给健康的猫科动物，导致传播的途径扩大。疫苗接种在一定程度上可以控制该病的蔓延，但不能消除；母源抗体在一定程度上也能控制易感动物的发病，但不是完全都是；而临床上更有一些不发病动物，它是病毒的携带者，不定期向外界排出病毒，引起健康动物感染或成为病毒的携带者。疫苗接种是对该病的最好预防措施，由于FCV毒株抗原的易变异性，就意味着没有疫苗能中和所有的病毒分离株，因此降低了疫苗的免疫保护作用，甚至出现某些疫苗彻底失效的问题。目前，国外应用范围比较广的FCV疫苗是单价苗，例如F9、FCV-255、F4等都是最常见的单价苗抗原毒株。国内主要使用的是德国勃林格公司产的猫鼻气管炎、嵌杯病毒病、猫泛白细胞减少症三联灭活疫苗，国产的猫疫苗，除了猫泛白细胞减少症疫苗外，基本是空白，急需国产猫疫苗的研制。灭活疫苗由完整的病毒组成，病毒灭活后，使其致病性丧失或减弱，但是仍然保持病毒的全部或部分免疫原性，接种后病毒抗原可以刺激机体产生免疫应答，达到保护作用。灭活疫苗中的病毒不具有感染性，在体内不能增殖，因此临床应用比较安全；保存方便，无需冻干保存；其它活病原体污染问题较少；生产相对简单。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供猫嵌杯病毒CH-JL5株和猫嵌杯病毒CH-JL5株灭活疫苗及其制备方法。猫嵌杯病毒CH-JL5株，它的保藏编号为：CGMCC No.12547。一种猫嵌杯病毒灭活疫苗，它是将保藏编号为：CGMCC No.12547的猫嵌杯病毒CH-JL5株，经过灭活后制备的；所述的灭活是采用甲醛灭活；一种猫嵌杯病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将F81细胞培养在生长液中，当细胞生长至对数期时，在该细胞中接种FCV，控制温度35-37℃，将F81细胞单层吸附FCV 1-2h；(2)细胞传代接毒剂量为0.1感染复数（MOI），将吸附了FCV的F81细胞置于细胞维持液中，静止培养；(3)当上述F81细胞有80％以上出现病变时，盲传13代，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞病毒液；(4)按Reed-Muench法计算病毒的TCID50，用无血清DMEM稀释至105.5TCID50/0.1ml，加入体积分数为0.2％的甲醛并不断搅拌，置22℃恒温摇床中(120r/min)灭活48h以上；(5)将上述步骤中得到的病毒液，按照2%的比例，加入氢氧化铝胶佐剂，充分混合均匀，得到FCV灭活苗。本专利技术提供了猫嵌杯病毒CH-JL5株及由其制备的灭活疫苗。本专利技术所述灭活疫苗采用皮下注射，免疫接种操作方便。实验结果表明所述灭活疫苗不会引起FCV毒力增强或导致基因整合，也不会引起猫结膜炎、鼻炎、口腔溃疡或急性死亡，安全无副作用。此外，所述猫嵌杯病毒灭活疫苗能诱导猫产生良好的体液免疫和细胞免疫，采用FCV CH-SH株进行攻毒试验，免疫保护率为96%；采用FCV 2080株进行攻毒试验，免疫保护率为100%；采用FCV USDA株进行攻毒试验，免疫保护率为100%。附图说明图1 FCV CH-JL5 在F81细胞上培养的结果；其中A为正常的F81细胞，B为被FCV感染的F81细胞；图2 FCV CH-JL5的电镜检测结果；图3 FCV CH-JL5 ORF2片段PCR结果（泳道M1为DL15000 Marker，泳道R为PCR产物，泳道M1为DL2000 Marker）；图4 FCV CH-JL5 ORF2核苷酸的同源性分析；图5 FCV CH-JL5 ORF2核苷酸的进化树分析；图6 FCV CH-JL5 ORF2氨基酸的同源性分析；图7 FCV CH-JL5 ORF2氨基酸的进化树分析。具体实施方式实施例1 猫嵌杯病毒CH-JL5株的分离和鉴定一、猫嵌杯病毒CH-JL5株的分离1、2013年5月，用口腔棉拭子采集吉林省临床疑似病猫的口腔唾液；2、样品的处理：猫口腔棉拭子加500μL PBS缓冲液溶解5min，3000r/min离心10min，将棉拭子弃去，混匀分出250μL备用；3、病毒的分离培养：样品3000r/min离心15min，取上清加入等量的DMEM营养液，用0.22μm滤器过滤除菌，接种F81单层细胞，置37℃5%CO2培养箱中培养，盲传至第2代出现明显病变，传至第5代时细胞病变稳定，表现为细胞圆缩，呈葡萄串样，最后完全脱落。二、猫嵌杯病毒CH-JL5株的鉴定1、电镜观察:取出现明显病变的病毒培养物上清接种于长成单层的F81细胞，传代3次，细胞培养物3000r/min离心10min，取上清以0.5%的磷钨酸负染，电镜观察。发现病毒粒子呈球形，无囊膜，符合FCV的形态特征；2、样品RNA的提取及反转录:参照RNA提取试剂盒的说明书提取上述制备液中的病毒RNA，再参照全式金北京生物技术有限公司的反转录试剂盒说明书进行反转录操作；3、病毒RNA的提取及RT本文档来自技高网...
【技术保护点】
猫嵌杯病毒CH‑JL5株，其特征在于：它的保藏编号为：CGMCC No.12547。
【技术特征摘要】
1.猫嵌杯病毒CH-JL5株，其特征在于：它的保藏编号为：CGMCC No.12547。2.一种猫嵌杯病毒灭活疫苗，其特征在于：它是将保藏编号为：CGMCC No.12547的猫嵌杯病毒CH-JL5株，经过灭活后制备的。3.根据权利要求2所述的一种猫嵌杯病毒灭活疫苗，其特征在于：所述的灭活是采用甲醛灭活。4.一种猫嵌杯病毒灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤：1)将F81细胞培养在生长液中，当细胞生长至对数期时，在该细胞中接种FCV，控制温度35-37℃，将F81细胞单层吸附FCV 1-2h；2)...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏振强，胡桂学，王开，金宏丽，应瑛，陈小庆，
申请(专利权)人：长春西诺生物科技有限公司，吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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