一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，属于生物技术领域，本发明专利技术所述的培养方法包括种子扩培和静置发酵产膜两个阶段，在种子扩培阶段的种子培养基中添加纤维素酶以扩大培养，其中纤维素酶的最终浓度为0.12～0.20U/ml。该方法可有效的将种子扩培阶段纤维素包裹的菌种释放出来，从而可有效的将种子扩培和纤维素发酵完全的分开，且在不影响后期产纤维素膜干重的前提下使产膜周期缩短一半以上，接种量也可降至不添加纤维素酶的工艺接种量的20％以下，降低了生产成本，且适合大规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法。
技术介绍
细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是指在不同条件下，由醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等中的某种微生物合成的纤维素的统称。与天然纤维素相比，细菌纤维素具有良好的吸水、透气性能、很强的亲水性、非凡的持水性(吸收600～700倍于其干基重的水分)、高纯度、高结晶度、高抗张强度及高持水能力等优点，被认为是目前世界上性能最好的纤维素。因此具有许多潜在的应用前景。目前在音响、食品、日化、医药、造纸等工业中已经实现了商业化应用，被认为是目前世界上性能最好的纤维素。自该产品面市以来，在国际市场上一直畅销不衰。现有细菌纤维素生产企业的生产能力远无法满足市场对细菌纤维素的大量需求。因此改进细菌纤维素的发酵工艺得到理想的产量已成为当今的研究热点。目前，细菌纤维素的发酵均采用静置培养，周期一般为5～10天，有些周期甚至更长，主要原因是木醋杆菌在种子培养的过程中就开始产纤维素，菌液中的菌体容易被纤维素膜吸附，溶液中的菌体浓度一般都在106～108CFU/ml，整个种子培养阶段没有明显的菌种扩培现象，有些会呈现越培养菌液越澄清的现象，虽然纤维素膜包裹了大量菌体，但后期接种静置发酵用的是种子液，即使接种前通过剧烈震荡或搅拌仍然不能大幅度增加菌液中的浓度，也就是说种子液内的菌体浓度无法达到较高水平，这种菌体繁殖与发酵产纤维素两个阶段无法分开的现象导致大规模生产很难实现。有研究尝试在种子培养阶段提高转速，加大对菌体的剪切力，尽量阻滞纤维素的产生，但结果并不理想。截至目前，只有为数不多的有关提高种子培养基中的菌浓的研究报道。中国专利CN200910193119公开了一种利用菠萝皮汁进行“二步法”发酵生产细菌纤维素的方法，采用将木醋杆菌菌体增殖与发酵生产细菌纤维素两个阶段分开，于22～28℃，在发酵过程中不断通入无菌空气，并用100～200rpm搅拌下培养24h～72h，此时木醋杆菌活菌数为108～109cfu/ml，经过菌体增殖培养，尽量使细胞处于同步生长时期，然后在菠萝皮清汁的发酵培养基中，浅盘静止培养72h～168h，得到细菌纤维素产量为17.5g/L以上。该方法使细菌纤维素的生产周期大大缩短，将菠萝皮进行了综合利用，保护了环境，生产出的细菌纤维素质构致密、均匀。但是该方法受到原料来源的限制，一般菠萝只在南方部分地区生长，每年只有几个月的盛产时间。所以该方法对于大部分地区是不适于规模化生产的。中国专利技术专利200710030072.0申请公开了“深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法”，该方法是将木醋杆菌接入20～100％的椰子水中进行84～132h(3.5～5.5天)的深层静态发酵，之后再装入浅盘进行 40～192h(1.7～8.0天)的产椰果的发酵，其优点是将木醋杆菌增值培养(非生产时间)与发酵产纤维素(生产时间)的两个阶段分开，在一定程度上可以缩短生产周期，提高生产效率。但是该工艺需要用到椰子水，对于生产同样会受到地域和时间的限制，不适于大规模稳定的生产。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷和不足，本专利技术提供了一种缩短细菌纤维素发酵生产周期的培养方法，该方法在种子培养基中添加纤维素酶，使得扩培阶段纤维素包裹的菌种被释放出来，从而使种子液中的菌浓提高，而且明显的将种子发酵与产膜发酵分成两个阶段，加快了细菌纤维素的合成速度，缩短了整个发酵周期。为了实现上述技术目的，本专利技术的技术方案提供了一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，包括种子扩培和静置发酵产膜两个阶段，在种子扩培阶段的种子培养基中添加纤维素酶。在本专利技术的一些实施方式中，纤维素酶的最终浓度为0.12～0.20U/ml。在本专利技术的一些实施方式中，种子扩培为先将斜面菌种接种于含纤维素酶培养基的摇瓶中培养，再将摇瓶培养后的菌液转接至种子罐中培养。在本专利技术的一些实施方式中，摇瓶培养的振速为120～300rpm，温度为25～32℃，培养时间为2～5h。在本专利技术的一些实施方式中，菌种选自木醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、巴氏醋杆菌、气杆菌属(Aerobacter)、根瘤杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、产碱杆菌属、八叠球菌属或动胶菌属。在本专利技术的一些实施方式中，种子罐中培养是在搅拌速度为100～200r/min，通气量为2-5vvm，罐压为28-32Kpa的条件下培养20～24h。在本专利技术的一些实施方式中，所述静置发酵产膜阶段，种子液接种到发酵产膜培养基的体积为发酵产膜培养基体积的2％。在本专利技术的一些实施方式中，静置发酵产膜是指将扩培后的种子液接种到静置发酵产纤维素的培养基混匀，然后，灌注到浅盘中静置培养，收膜即可。在本专利技术的一些实施方式中，浅盘培养是在28～32℃静置培养2～3天，其中浅盘装液深度为5～10mm。在本专利技术的一些实施方式中，纤维素酶可以一次性加入到摇瓶培养基中，也可以先在摇瓶培养基中添加一部分，转接至种子罐时再补充纤维素酶至终浓度为0.12～0.20U/ml。所述的一部分应保证摇瓶中纤维素酶的浓度为0.12U/ml以上。在本专利技术的一些实施方式中，种子培养基各组分的质量/体积分数为：Na2HPO4·12H2O 0.1～0.2％，MgSO4·7H2O 0.01～0.03％，柠檬酸0.1～0.2％，葡萄糖0.5～2％，(NH4)2HPO4 0.2～0.4％，玉米浆干粉1～2％。在本专利技术的一些实施方式中，发酵产膜培养基中各组分的质量/体积分数为：KH2PO4 0.2％，Na2HPO4·12H2O 0.2％，MgSO4·7H2O 0.03％，柠檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH4)2SO4 0.2％。在本专利技术的一些实施方式中，所用的器皿均为已灭菌的。在本专利技术的一些实施方式中，所用的水均为纯化水。除非明确地说明与此相反，否则，本专利技术引用的所有范围包括端值。例如，“纤维素酶的最终浓度为0.12～0.20U/ml”，表示纤维素酶的最终浓度为0.12≤C≤0.20U/ml。本专利技术所述的“纤维素酶的最终浓度为”，指的是纤维素酶在种子罐中的终浓度。本专利技术所述的“种子液”为在种子罐中扩培后的菌液。本专利技术所述的“斜面菌种”为将生产菌种接种于斜面培养基上，于25℃～32℃静置培养2～3天，即得。斜面培养基的组分为(质量比)：蔗糖2％～4％，硫酸铵0.2％～0.6％，硫酸镁0.01％～0.05％，氯化钙0.01％～0.04％，七水硫酸亚铁0.0003％～0.0010％，乙酸钠0.04％～0.10％，酵母膏0.03％～0.10％，琼脂2％，其余为水。本专利技术中的数字均为近似值，无论有否使用“大约”或“约”等字眼。数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。本专利技术使用的术语“或”表示备选方案，如果合适的话，可以将它们本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，包括种子扩培和静置发酵产膜两个阶段，其特征在于，在种子扩培阶段的种子培养基中添加纤维素酶。

【技术特征摘要】
2015.05.28 CN 20151028379371.一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，包括种子扩培和静置发酵产膜两个阶段，其特征在于，在种子扩培阶段的种子培养基中添加纤维素酶。2.根据权利要1所述的方法，其特征在于，所述的纤维素酶的最终浓度为0.12～0.20U/ml。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述静置发酵产膜阶段，种子液接种到发酵产膜培养基的体积为发酵产膜培养基体积的2％。4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述的种子扩培为先将斜面菌种接种于含纤维素酶培养基的...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍素敏，毛兴艳，吴波，张鸿，曾佳，凃丽，李利佳，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44