本发明专利技术公开了一种耐草甘膦棉花新种质BG2-7的检测方法及侧翼序列。本发明专利技术所提供的用于检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的引物对，由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成。本发明专利技术根据陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的5’侧翼序列设计得到所述引物对。实验证明，利用该引物对通过PCR的方法可检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412，且该方法准确率高、特异性强、灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种耐草甘膦转基因陆地棉BG2-7的检测方法及侧翼序列。
技术介绍
我国是棉花生产大国，年种植棉花面积约470万公顷，年产皮棉500万吨，占世界产棉总量的25％左右。棉花生产的兴衰对我国经济的发展具有举足轻重的影响。然而，中国棉田生态型复杂，杂草危害较重，尤其是长江流域棉区，生长前期正值梅雨季节，杂草生长旺盛，加之阴雨连绵，不能及时除草，杂草危害极其严重，可造成14.0％-16.0％的损失，严重制约了棉花的优质、高效生产(马小艳,马艳,彭军等.我国棉田杂草研究现状与发展趋势.棉花学报,2010,22(4):372-380)。转基因抗除草剂棉花的培育对于稳定棉花生产有着举足轻重的作用。草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，具有高效、广谱、低毒、低残留、不破坏土壤环境、对大多数植物具有灭生性等其它除草剂所不可比拟的优点，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理。草甘膦是植物体内5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshiki-mate-3-phosate，EPSP)的一种类似物，它的毒性机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)合成EPSP，从而抑制EPSP合酶的活性导致分枝酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡(McDowell LM,Klug CA,Beusen DD.Ligand geometry of the ternary complex of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from rotational-echo double-resonance NMR.Biochem,1996,35(17):5395-5403；Sammons RD,Gruys KJ,Anderson KS et al.Reevaluating glyphosate as a transition-state inhibitor of EPSP synthase:identification of an EPSP synthase.EPSP.glyphosate ternary complex.Biochem,1995,34(19):6433-6440)。基于草甘膦的毒性机理，研究者们通过三种途径获得了抗除草剂的转基因植物。一是EPSPS基因发生突变，产生与草甘膦亲和性较低的EPSPS，突变后的EPSPS不能很好的甚至根本不能与草甘膦结合，从而使草甘膦丧失了对EPSPS的竞争性抑制作用。Comai等首先从鼠伤寒沙门氏菌中筛选出了抗草甘膦的突变菌株，随后分离突变基因-aroA基因，此突变aroA基因转入大肠杆菌获得了抗草甘膦表型(Comai L,Facciotti D,Hiattl WR et al.Expression in plants of a mutant aro A gene from Salmonella typhimurium Confers tolerance to glyphosate.Nature,1985,(317):741-744；Comai L,Sen
LC,stalker DM.An altered aroA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate.Sci,1983,(221):270-271)。其后，Duncan等克隆了抗草甘膦诱变的矮牵牛、土豆、拟南芥、大豆、油菜和大肠杆菌K-12的EPSP合酶基因(Duncan K,Coggins JR.The Serc aroA operon of Escherichia Coli.Biochem J,1986,(234):49-57；Duncan K,Lewendon A,Coggins JR.Mutant EPSP Synthase genes from tomato,Arabidopsis thaliana,Brassica napus,Glycine max E.Coli K12Confer folerance to glyphosate.FEBS lett,1984,(170):59-63)。二是过量表达产生具有较高酶活性的EPSP合酶：对百脉根属9个草甘膦耐药性水平不同的无性系植株(营养体无性系)草甘膦茎叶处理后药液的滞留、吸收、输导以及耐药性水平与EPSP合酶活性关系进行研究的结果表明，它们在药剂的滞留、吸收、输导等方面无明显差异，而EPSP合酶的活性与无性系对草甘膦的耐药性呈正相关(Boerboom CM,Wyse DL,Somers DA.Mechanism of glyphosate tolerance in birdsfoot trefoil(Lotus corniculatus L).Weed Sci,1990,38:463–467)。Shah等培育并筛选出了具有对草甘膦抗性的矮牵牛细胞系MP4-G，MP4-G细胞系中的EPSP合酶基因由于扩增了20倍，过量产生EPSP合酶的mRNA，从而能超量产生EPSP合酶(Shah DM,Horsch RB,Klee HJ.Engineering Herbicide Tolerance in Transgenic plants.Sci,1986,(233)：478-491)。1987年，Mollenhauer等用35S启动子驱动MP4-G细胞系中的EPSP合酶基因的表达，并用农杆菌介导法转化矮牵牛。结果发现转化过程中长出的愈伤组织能在含0.5M的草甘膦的培养基上生长，愈伤组织中EPSP合酶的活性提高了40倍，转化植株在温室中能抗0.18磅·公倾-1的草甘膦(Mollenhauer C,Smart C,Amrhein N.Glyphosate toxicity in the shoot apical region of the tomato.Plant Pest Biochem Physiol,1987,(29):55-65)。三是表达天然来源的抗草甘膦EPSP合酶。美国孟山都公司在根癌农杆菌CP4中发现了抗草甘膦的EPSP合酶。这类EPSP合酶与以往克隆的酶氨基酸序列差异很大，同源性低于50％，表现出了对草甘膦的高抗性和对底物(PEP)的高亲和力(Padgette SR,Kolacz KH,Delannay X.Development,identification,and characterization of a glyphosatetolerant soybean line.Crop Sci,1995,35:1451-1461)，目前CP4-EPSPS已被广泛用于商业化种植的抗草甘膦转基因作物中。近年来，我国对草甘膦抗性菌株和基因资源方面的研究取得了较大的进步，克隆了一系列抗草甘膦的基因。G2-aroA为中国农业科学院生物技术研究所林敏实验室从草甘膦污染的极端环境中分离的新型高抗草甘膦EPSP合酶编码基因(刘柱,陈明,徐玉泉等.一株草甘膦极端抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2‑7CGMCC No.10412的引物对；所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成。
【技术特征摘要】
1.用于检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的引物对；所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成。2.权利要求1所述的引物对在制备用于检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的试剂盒中的应用。3.用于检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的试剂盒，包含有权利要求1所述的引物对。4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装。5.权利要求1所述引物对或权利要求3所述试剂盒在检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412中的应用。6.检测或辅助检测待测棉花是否为陆地棉(Gossypium hirsutum)BG2-7CGMCC No.10412的方法，包括如下步骤：(b1)以所述待测棉花的基...
【专利技术属性】
技术研发人员：王旭静，王志兴，唐巧玲，张小兵，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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