优生优育检测试剂盒、检测用寡核苷酸和方法技术

本发明专利技术提供了一种用于优生优育检测的寡核苷酸、试剂盒和方法，包括检测巨细胞病毒的引物和探针、检测单纯疱疹病毒的引物和探针、检测弓形虫的引物和探针、检测风疹病毒的引物和探针、检测单纯疱疹病毒I型的引物和探针、检测单纯疱疹病毒II型的引物和探针。本发明专利技术能够快速地诊断和鉴别TORCH感染情况，具有检测周期短，特异性好，准确度高，灵敏度高，条件依赖少，污染风险低等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因检测领域，具体涉及用于优生优育的TORCH(如弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等)检测项目的试剂盒、检测试剂和方法。
技术介绍
TORCH是一组病原微生物英文字母的缩写，T指刚地弓形虫(toxoplasma，TOX)，O指其他微生物(Others，如柯萨奇病毒、梅青螺旋体、微小病毒、乙肝病毒等)，R是指风疹病毒(rubella virus，RV)，C指巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)，H指单纯疱疹病毒(herpes simplx virus，HSV)I、II型。此组病原体所引起的感染称之为TORCH感染。这几种病原体感染的范围广、危害大，孕妇由于内分泌系统的改变导致机体免疫力下降，容易发生原发性感染，以前感染过的孕妇体内潜伏的病毒也容易被激活而发生复发感染。妊娠期感染不仅危害母体，往往还对胎儿和新生儿产生严重不良后果，可以导致流产、早产、死胎或者胎儿生长迟缓和发育畸形，通过产道和母乳可以引起新生儿感染，如果累及神经系统，可造成不同程度的智力障碍以及各种瘫痪、失聪、失明等严重后遗症，从而影响人口素质。弓形虫感染是TORCH病原体中唯一的人畜共患传染病，如猫、犬、羊、鸡均可成为感染源，弓形虫可通过人的伤口进入人体，食用未煮熟的肉类或污制品、饮用污染的水或吸入病畜排泄飞沫而被感染。感染后绝大多数为隐性感染，患者没有明显的症状和体征，对于妊娠期妇女孕初3个月感染，对胎儿造成严重影响，可导致流产、早产、死产或畸形。风疹病毒通过呼吸道感染，感染孕妇后能直接通过胎盘屏障，传播给胎儿的感染率随着孕期的进展而降低，因此妊娠期确定风疹感染的时间很重要。巨细胞病毒属于疱疹病毒，主要通过与排毒者密切接触而感染，是宫内感染危害最大的致畸病原体之一。孕妇感染后，可能引起病毒血症，通过血液、胎盘屏障、羊水等感染胎儿，致胚胎发育异常，造成流产、死胎、早产、畸形等。临床上，识别巨细胞病毒的感染情况对进一步鉴定胎儿感染后有无器官功能损坏，以及出生后有无后遗症有很重要的作用。单纯疱疹病毒有I、II型，其中以II型感染为主，传播途径主要是产道感染，孕早期对胎儿的损害大于妊娠晚期，对孕早期的影响主要是致胎儿流产、先天畸形、早产等。TORCH感染已经受到全世界医学界尤其是妇产科和儿科医生的高度重视。欧美等发达国家早在七十年代就将风疹、弓形虫、巨细胞病毒等检测列为孕期筛查项目。在我国随着优生优育工作的深入进行，孕期TORCH检测逐步在医疗及计划生育部门开展起来。目前TORCH感染的临床诊断方法包括病原学检查、血清学检查、基因诊断等方法。病原学检查包括体液或活组织穿刺物涂片、组织切片、镜检和病原体的分离和培养。一旦镜检发现或分离培养证实病原体的存在，即可确诊。但涂片、切片检测率低，且所需时间长，费用高，不适合作为常规检查项目。血清学检查目前应用最多的是酶联免疫吸附试验(ELISA)，利用抗原抗体特异性结合的原理检测血清中抗原或抗体的存在。TORCH在临床诊断中通常针对lgM或lgG。lgM在早期出现，以后被lgG替代。我国习惯使用TORCH 4项的IgM进行筛查，但IgM抗体试验影响因素很多，且国内人群TORCH各项目IgM阳性率不高，单纯使用IgM筛查容易出现假阳性。另外随着生活方式的多样化，HSV I生殖道感染的比例在逐年增加，如不区分HSV I和HSV II的筛查方法极易造成孕妇围产期未经鉴别的HSV感染，给新生儿造成潜在严重危害。因此为获得更加准确可靠的结果，同时进行TORCH筛查是必须的。基因诊断包括用核酸序列为探针进行的分子杂交和已核酸扩增为基础的聚合酶链式反应(PCR)等，这类检测灵敏度高，能直接检测病原体的遗传物质，证明病原体的存在。检测样本多取材于孕妇羊水细胞、静脉血、绒毛标本、胎儿脐带血、尿、乳汁等。然而核酸斑点杂交、核酸原位杂交方法欠灵敏，特异性不高，不能作为临床常规诊断，现在普遍认为PCR法具有重复性好、特异性强、灵敏度高的特点，可使极微量的靶基因样品扩增百万倍，具有很高的敏感性，克服了漏检。随着PCR方法的使用，相继出现TORCH病原体单项PCR检测试剂，由于TORCH感染的症状、后果均相似，孕妇只得同时进行多项检测，使得价格较高，尚难在孕妇中广泛开展。目前采用PCR方法筛查TORCH时，需要单独四管分别检测弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒的情况。为了确定样本为HSV的哪种型别，甚至要使用五管分别检测弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型的情况。这样不仅要消耗病人更多的样本，同时也极大地增加试剂和人力成本。
技术实现思路
为了克服上述TORCH检测中的不足，本专利技术提供了一种用于优生优育检测的寡核苷酸包括：检测巨细胞病毒的引物和探针序列为：HCMV FP：AAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAHCMV RP：AGGGCCAGAAGCATCTGGTAAHCMV P：ACCGGGACCACCGTCGTCTGA检测单纯疱疹病毒的引物和探针序列为：HSV通用FP：GGAGAGGGACATCCAGGACTHSV通用RP：CATGAGCTTGTAATACACCGTCAHSV通用P：CTCACCGCCGAACTGAGCAGACA检测弓形虫的引物和探针序列为：TOX FP：AGCCACAGAAGGGMCAGAAGTTOX RP：CTCGYCGCYTCCCAACCATOX P：ATGCCGCTCCTCCAGCCGTC检测风疹病毒的引物和探针序列为：RV FP：CGCATYTGGAAYGGYACRV RP：GYRAACACRCTCATCACRV P：AAGCARTACCAYCCYACCG检测单纯疱疹病毒I型的引物和探针序列为：HSV-1FP：TGCAGAGCAACCCCATGAAGHSV-1RP：GGCCTCGTCAAARTCGCCHSV-1P：CTCAAGAACCCCACCARCCCGGA检测单纯疱疹病毒II型的引物和探针序列为：HSV-2FP：CTCCGGGTTTCACGTCGAHSV-2RP：CGCAGGGAGAGCGTACTGAHSV-2P：TGGTGGTGTTTGACTTTGCCAGCC其中所述的M代表A或C，R代表A或G，Y代表C或T。所述探针5`端的荧光基团标记为FAM、VIC、Texas Red、Cy5或HEX。进一步地，探针HCMV P的5`端标记的荧光基团为FAM，探针HSV通用P的5`端标记的荧光基团为VIC，探针TOX P的5`端标记的荧光基团为Texas Red，探针RV P的5`端标记的荧光基团为Cys5，探针HSV-1P的5`端标记的荧光基团为FAM，探针HSV-2P的5`端标记的荧光基团为VIC。本专利技术还提供了一种用于优生优育的TORCH检测试剂盒，包括DNA/RNA核酸提取试剂、荧光定量PCR扩增反应液、酶混合液、阳性对照品和阴性对照品，荧光定量PCR扩增反应液包括PCR反应液1和PCR反应液2，所述PCR反应液1包括检测巨细胞病毒的引物和探针、检测单纯疱疹病毒的引物和探针、检测弓形虫的引物和探针、检测风疹病毒的引物和探针，其中，检测巨细胞病毒的引物和探针序列为：HCMV FP：AAGTGTTTATAATTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于优生优育检测的寡核苷酸，其特征在于，包括检测巨细胞病毒的引物和探针、检测单纯疱疹病毒的引物和探针、检测弓形虫的引物和探针、检测风疹病毒的引物和探针、检测单纯疱疹病毒I型的引物和探针、检测单纯疱疹病毒II型的引物和探针，其中，检测巨细胞病毒的引物和探针序列为：HCMV FP：AAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAHCMV RP：AGGGCCAGAAGCATCTGGTAAHCMV P：ACCGGGACCACCGTCGTCTGA检测单纯疱疹病毒的引物和探针序列为：HSV通用FP：GGAGAGGGACATCCAGGACTHSV通用RP：CATGAGCTTGTAATACACCGTCAHSV通用P：CTCACCGCCGAACTGAGCAGACA检测弓形虫的引物和探针序列为：TOX FP：AGCCACAGAAGGGMCAGAAGTTOX RP：CTCGYCGCYTCCCAACCATOX P：ATGCCGCTCCTCCAGCCGTC检测风疹病毒的引物和探针序列为：RV FP：CGCATYTGGAAYGGYACRV RP：GYRAACACRCTCATCACRV P：AAGCARTACCAYCCYACCG检测单纯疱疹病毒I型的引物和探针序列为：HSV‑1FP：TGCAGAGCAACCCCATGAAGHSV‑1RP：GGCCTCGTCAAARTCGCCHSV‑1P：CTCAAGAACCCCACCARCCCGGA检测单纯疱疹病毒II型的引物和探针序列为：HSV‑2FP：CTCCGGGTTTCACGTCGAHSV‑2RP：CGCAGGGAGAGCGTACTGAHSV‑2P：TGGTGGTGTTTGACTTTGCCAGCC其中所述的M代表A或C，R代表A或G，Y代表C或T。...

【技术特征摘要】
1.用于优生优育检测的寡核苷酸，其特征在于，包括检测巨细胞病毒的引物和探针、检测单纯疱疹病毒的引物和探针、检测弓形虫的引物和探针、检测风疹病毒的引物和探针、检测单纯疱疹病毒I型的引物和探针、检测单纯疱疹病毒II型的引物和探针，其中，检测巨细胞病毒的引物和探针序列为：HCMV FP：AAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAHCMV RP：AGGGCCAGAAGCATCTGGTAAHCMV P：ACCGGGACCACCGTCGTCTGA检测单纯疱疹病毒的引物和探针序列为：HSV通用FP：GGAGAGGGACATCCAGGACTHSV通用RP：CATGAGCTTGTAATACACCGTCAHSV通用P：CTCACCGCCGAACTGAGCAGACA检测弓形虫的引物和探针序列为：TOX FP：AGCCACAGAAGGGMCAGAAGTTOX RP：CTCGYCGCYTCCCAACCATOX P：ATGCCGCTCCTCCAGCCGTC检测风疹病毒的引物和探针序列为：RV FP：CGCATYTGGAAYGGYACRV RP：GYRAACACRCTCATCACRV P：AAGCARTACCAYCCYACCG检测单纯疱疹病毒I型的引物和探针序列为：HSV-1FP：TGCAGAGCAACCCCATGAAGHSV-1RP：GGCCTCGTCAAARTCGCCHSV-1P：CTCAAGAACCCCACCARCCCGGA检测单纯疱疹病毒II型的引物和探针序列为：HSV-2FP：CTCCGGGTTTCACGTCGAHSV-2RP：CGCAGGGAGAGCGTACTGAHSV-2P：TGGTGGTGTTTGACTTTGCCAGCC其中所述的M代表A或C，R代表A或G，Y代表C或T。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述探针5`端的荧光基团标记为FAM、VIC、Texas Red、Cy5或HEX。3.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，探针HCMV P的5`端标记的荧光基团为FAM，探针HSV通用P的5`端标记的荧光基团为VIC，探针TOX P的5`端标记的荧光基团为Texas Red，探针RV P的5`端标记的荧光基团为Cys5，探针HSV-1P的5`端标记的荧光基团为FAM，探针HSV-2P的5`端标记的荧光基团为VIC。4.优生优育检测试剂盒，包括DNA/RNA核酸提取试剂、荧光定量PCR扩增反应液、酶混合液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于，荧光定量PCR扩增反应液包括PCR反应液1和PCR反应液2，所述PCR反应液1包括检测巨细胞病毒的引物和探针、检测单纯疱疹病毒的引物和探针、检测弓形虫的引物和探针、检测风疹病毒的引物和探针，其中，检测巨细胞病毒的引物和探针序列为：HCMV FP：AAGTGTTTATAATTCTGGTCGCAHCMV RP：AGGGCCAGAAGCATCTGGTAAHCMV P：ACCGGGACCACCGTCGTCTGA检测单纯疱疹病毒的引物和探针序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈斐斐，张太松，毛露茜，刘学峰，
申请(专利权)人：艾康生物技术杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33