本发明专利技术量子点‑β‑HCG单抗偶联物的制备方法及其应用，涉及纳米生物技术领域。量子点通过EDC等交联剂偶联β‑HCG单抗；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质经电泳分离开后转移至PVDF膜，与量子点标记的β‑HCG单抗进行特异性结合，在紫外凝胶成像系统下即可得到免疫印迹结果图。本发明专利技术以量子点作为显色剂，偶联β‑HCG单抗，可以有效缩短免疫印迹时间并且提高准确度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米生物
，尤其涉及量子点偶联β-HCG单抗的方法及其在免疫印迹中的应用。
技术介绍
免疫印迹(Western blot) ，在分子生物学及相关领域应用广泛，主要应用于蛋白的定性和半定量分析。但该方法步骤烦琐，耗时长，化学发光检测所用的有机荧光发色团荧光稳定性低，难以长时间成像，使得检测灵敏度低。不同的发色团需要不同波长的光源激发，使成像复杂化，且不能同时检测多种蛋白。量子点(Quantum dots, QDs)是一种半导体纳米晶体，半径小于或等于玻尔半径，因此量子点表现出独特的光学、电、磁和催化特性。与传统有机染料分子探针相比，量子点的发射光谱宽度窄、可调，且分布对称；其激发光谱宽，且连续分布，可用一种波长激发大小不同的同种量子点而获得多种标记颜色；光稳定性强；斯托克斯位移较大；生物相容性好；荧光寿命长[Wegner KD, Lanh PT, Jennings T, et al. Influence of luminescence quantum yield, surface coating, and functionalization of quantum dots on the sensitivity of time-resolved fret bioassays [J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2013, 5(8): 2881]。目前，量子点与生物分子偶联常用的技术有配位键结合、静电吸附、共价偶联等。蛋白中某种特定氨基酸才能与金属离子产生配位作用，因此应用不广泛；静电吸附得到的偶联物稳定性较差。表面带有羧基的水溶性量子点通过EDC等交联剂可以与蛋白质分子的氨基共价偶联，得到的偶联物具有良好的生物活性，且光学性质良好。基于量子点的免疫印迹在理论上具有光稳定性强，灵敏度高，可多重标记的特点，能定性定量检测蛋白，准确度高，不需要化学发光试剂，成像系统简单，耗时短。2005年，Ornberg首次报道将量子点应用到免疫印迹中，利用量子点标记二抗检测不同浓度的MAPK，在不同曝光时间下检测到其蛋白浓度与荧光强度有线性关系。该方法灵敏度高，光化学性能稳定[Ornberg RL, Harper TF, Liu H. Western blot analysis with quantum dot fluorescence technology: a sensitive and quantitative method for multiplexed proteomics [J]. Nat Methods, 2005, 2(1): 79]。中国专利申请CN 101241140A《基于量子点标记的免疫印迹检测方法》，涉及了基于量子点标记二抗的免疫印迹方法，该法仍旧需要经过一抗的孵育，实验步骤较多，并且必须使用二抗，实验成本较为昂贵。本专利技术的目的之一是，提供一种量子点标记单抗蛋白的方法。本专利技术的目的之二是，提供一种基于量子点的免疫印迹，且能简便定量测定蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于开发基于量子点的Western blot定量检测蛋白，提供一种耗时短且线性关系良好的方法。本专利技术的优点在于采用简单有效的方法制备CdTe量子点-β-HCG单抗偶联物，并在Western blot检测中表现出良好的线性关系和稳定性。本专利技术是通过以下技术方案实现的：量子点通过EDC等交联剂偶联β-HCG单抗；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质经电泳分离开后转移至PVDF膜，与量子点标记的β-HCG单抗进行特异性结合，在紫外凝胶成像系统中检测，得到各条带荧光强度，进行定性定量分析。本专利技术的具体技术方案如下：量子点-β-HCG单抗偶联物的制备方法及其应用，按照下述步骤进行：（1）量子点偶联β-HCG单抗偶联时，加入磷酸盐调节反应液pH，在巯基丙酸修饰的CdTe量子点中先加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）溶液活化反应10-15 min，再加入NHS溶液反应10-15 min，最后加入β-HCG单抗于37℃反应2-4 h。反应结束后，将得到的偶联物离心去沉淀，上清液经超滤离心管离心，并用磷酸缓冲液洗涤，最后浓缩后4℃保存。（2）基于量子点的免疫印迹法蛋白样品经过SDS-PAGE电泳按分子量大小分离，转至PVDF膜后并封闭，用量子点标记的β-HCG单抗做为一抗孵育，膜上目的蛋白即能与之进行特异性结合，最后采用紫外凝胶系统检测成像。蛋白经SDS-PAGE电泳按分子量大小分离，再将PVDF膜于甲醇中激活，采用湿法转膜。将转好的膜放入5%脱脂牛奶中，震荡封闭1 h。用TBS溶液稀释成一系列浓度的量子点-β-HCG单抗偶联物，室温下孵育2 h。反应后直接将膜置于紫外凝胶系统中检测成像。观察荧光条带，并检测各条带荧光强度，得出线性关系。其中所述的的量子点，其表面带有羧基的CdTe量子点，发射波长为520 nm - 600 nm中的一种。其中步骤（1）中加入的量子点与EDC质量比为1:0.4 - 1:1，EDC与NHS质量比为1: 0.1 - 1: 0.3。调节反应pH为7.0 – 8.0，每步反应10-15 min。最后加入的量子点与β-HCG单抗质量比为1: 0.1-1: 0.5。其中所述的量子点-β-HCG单抗偶联物的应用，检测的目的蛋白条带可针对HCG和β-HCG进行特征检测，并根据其荧光强度进行定量测定。有益效果（1）本专利技术的优点和效果在于采用化学交联剂的方法，制备了量子点-β-HCG单抗偶联物，该偶联物经实验证明具有良好的生物活性和光学特性；基于量子点的免疫印迹耗时短，步骤简单，不需要加入显色液，节约成本，光学稳定性强，在TBS缓冲液中可保存5天以上，且荧光强度无太大变化。（2）本专利技术拓展了免疫印迹在微量检测蛋白中的应用，并且可以推广到其他类别蛋白的微量检测，其中量子点可自制，且不需要二抗，节约成本，定性定量结果均优于传统免疫印迹，具有良好的产业化前景。具体实施方式以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。实施例1：量子点-β-HCG单抗偶联物的制备将巯基丙酸（MPA）修饰的CdTe量子点（发射波长520 nm）于0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，配制成1 mg/mL。取量子点0.2 mg，加入磷酸缓冲液稀释至1 mL，加入0.877 g/mL 的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）0.09 μL，于旋转培养器上活化反应10 min。再加入 0.1 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）7.6 μL，继续反应10 min。最后加入9 mg/mL的β-HCG单抗2μL。37℃下反应2 h，得到的偶联物10000 rpm离心去沉淀，上清液经10KD超滤离心管离心浓缩后4℃保存。偶联物经琼脂糖凝胶电泳分析，与未偶联的量子点和β-HCG单抗相比，迁移速度变慢，确认其偶联成功。实施例2：量子点-β-HCG单抗偶联物的制备将巯基丙酸（MPA）修饰的CdTe量子点（发射波长550 nm）于0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，配制成1 mg/mL。取量子点0.3 mg，加入磷酸缓冲液稀释至1本文档来自技高网...
【技术保护点】
量子点‑β‑HCG单抗偶联物的制备方法及其应用，其特征在于按照下述步骤进行：（1）量子点偶联β‑HCG单抗偶联时，加入磷酸盐调节反应液pH，在巯基丙酸修饰的CdTe量子点中先加入1‑乙基‑3‑（3‑二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）溶液活化反应10‑15 min，再加入NHS溶液反应10‑15 min，最后加入β‑HCG单抗于37℃反应2‑4 h；反应结束后，将得到的偶联物离心去沉淀，上清液经超滤离心管离心，并用磷酸缓冲液洗涤，最后浓缩后4℃保存；（2）基于量子点的免疫印迹法蛋白样品经过SDS‑PAGE电泳按分子量大小分离，转至PVDF膜后并封闭，用量子点标记的β‑HCG单抗做为一抗孵育，膜上目的蛋白即能与之进行特异性结合，最后采用紫外凝胶系统检测成像；蛋白经SDS‑PAGE电泳按分子量大小分离，再将PVDF膜于甲醇中激活，采用湿法转膜；将转好的膜放入5%脱脂牛奶中，震荡封闭1 h；用TBS溶液稀释成一系列浓度的量子点‑β‑HCG单抗偶联物，室温下孵育2 h；反应后直接将膜置于紫外凝胶系统中检测成像；观察荧光条带，并检测各条带荧光强度，得出线性关系。
【技术特征摘要】
1.量子点-β-HCG单抗偶联物的制备方法及其应用，其特征在于按照下述步骤进行：（1）量子点偶联β-HCG单抗偶联时，加入磷酸盐调节反应液pH，在巯基丙酸修饰的CdTe量子点中先加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）溶液活化反应10-15 min，再加入NHS溶液反应10-15 min，最后加入β-HCG单抗于37℃反应2-4 h；反应结束后，将得到的偶联物离心去沉淀，上清液经超滤离心管离心，并用磷酸缓冲液洗涤，最后浓缩后4℃保存；（2）基于量子点的免疫印迹法蛋白样品经过SDS-PAGE电泳按分子量大小分离，转至PVDF膜后并封闭，用量子点标记的β-HCG单抗做为一抗孵育，膜上目的蛋白即能与之进行特异性结合，最后采用紫外凝胶系统检测成像；蛋白经SDS-PAGE电泳按分子量大小分离，再将PVDF膜于甲醇中激活，采用湿法转膜；将转好的膜放入5%脱脂牛奶中，震荡封闭1 h；用TBS溶液稀释成一系列浓度的量子点-β-...
【专利技术属性】
技术研发人员：童珊珊，余江南，徐希明，周玮婷，刘宏飞，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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