一种用于创伤修复富含干细胞提取物的可降解生物膜的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于创伤修复富含干细胞提取物的可降解生物膜的制备方法，按照如下步骤进行：抽取的骨髓加入至骨髓间充质培养液中，离心后弃上清液，之后以1×109个/mL接种于培养皿中，置于培养箱中培养，取第三代骨髓间充质干细胞接种于铺有纤维蛋白膜的培养板中，制得骨髓间充质干细胞‑纤维蛋白膜。本发明专利技术通过分离培养骨髓间充质干细胞，以纤维蛋白膜作为支架材料，将体外培养的骨髓间充质干细胞与纤维蛋白膜结合，移植到软骨受损部位以达到修复损伤软骨的作用。骨髓间充质干细胞可以依托纤维蛋白膜更好地局限于软骨受损创面表面生长增殖，使其能更有效的在软骨创面修复过程中发挥重大作用，为人体软骨损伤修复起到一定的指导作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，特别是涉及一种用于创伤修复富含干细胞提取物的可降解生物膜的制备方法。
技术介绍
骨髓间充质干细胞已成为21世纪生命科学研究的重点，它能够自我增殖和多向分化，具有极为广阔的应用前景。目前，骨髓间充质干细胞已在动物实验和临床应用中取得了巨大的成果，在骨或软骨损伤、心脏疾病、中枢神经系统损伤、肝损伤、脊髓损伤等方面都有突破，而且它不像人类胚胎干细胞一样涉及伦理道德方面的问题。骨髓间充质干细胞的分离方法众多，目前为止尚未发现一个特定的细胞标记可以鉴定骨髓间充质干细胞，而且骨髓间充质干细胞在不同的生长时期和不同的生长条件下具有较大的表达差异。目前组织工程使用的支架材料主要分为两类：化学合成材料和生物天然材料。两类材料皆有大量研究和临床试验报道。其中化学合成材料包括聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸与聚乙醇酸的共聚体和聚乙二醇等；生物天然材料包括胶原、丝素蛋白、藻酸盐、壳聚糖以及透明质酸等。化学合成材料力学性能强、但材料本身难以降解，生物相容性较差，体内植入可能会引发排斥和侵姓反应。生物天然材料以其与天然细胞外基质相接近的特性，具有优异的生物相容性，降解产物无毒无害，能够被机体吸收利用，更受研究者们的青睐。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于创伤修复富含干细胞提取物的可降解生物膜的制备方法，通过分离培养骨髓间充质干细胞，以纤维蛋白膜作为支架材料，将体外培养的骨髓间充质干细胞与纤维蛋白膜结合，移植到软骨受损部位以达到修复软骨损伤的作用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种用于创伤修复富含干细胞提取物的可降解生物膜的制备方法，按照如下步骤进行：步骤(1)、于基础培养基中加入青霉素和链霉素，配制成骨髓间充质培养液；步骤(2)、无菌条件下将抽取的的骨髓与步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液混合后加入无菌培养瓶中，体积比为1:1，制得骨髓细胞悬液；步骤(3)、将所述步骤(2)中得到的骨髓细胞悬液离心后弃上清液，得到骨髓干细胞群；步骤(4)、取所述步骤(4)中得到的骨髓干细胞群加入所述步骤(1)中制得的骨髓间充质培养液中重悬后过滤，之后以1×109个/mL接种于培养皿中，置于培养箱中培养；步骤(5)、原代培养24-48h后第一次换液，之后每3d换液一次，第三次换液12-18h后以1:2比例传代培养；步骤(6)、无菌条件下于新鲜血浆中加入抗凝剂，离心后吸取上层血浆与凝血酶1:1混合后均匀铺于无菌6孔板中，静置后即得到纤维蛋白膜；步骤(7)、取步骤(5)中培养的第三代骨髓间充质干细胞以1×105个/mL接种于铺有纤维蛋白膜的无菌6孔板中，置于培养箱中培养，制得骨髓间充质干细胞-纤维蛋白膜。进一步地，步骤(1)中所述基础培养基为L-DMEM培养基，所述青霉素浓度为100U/mL，所述链霉素浓度为100U/mL。进一步地，所述步骤(3)中离心速率为800-1500r/min，离心时间为5-10min。进一步地，所述步骤(4)中用70μm无菌尼龙过滤器过滤。进一步地，步骤(4)中所述培养箱为37℃、CO2饱和湿度培养箱。进一步地，步骤(6)中所述抗凝剂为柠檬酸钠，所述离心速率为3000g，所述离心时间为20-40min。进一步地，步骤(7)中所述培养箱为37℃、CO2饱和湿度培养箱，所述培养时间为24-48h。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过分离培养骨髓间充质干细胞，以纤维蛋白膜作为支架材料，将体外培养的骨髓间充质干细胞与纤维蛋白膜结合，移植到软骨受损部位以达到修复损伤软骨的作用。骨髓间充质干细胞可以依托纤维蛋白膜更好地局限于软骨受损创面表面生长增殖，使其能更有效的在软骨创面修复过程中发挥重大作用，为人体软骨损伤修复起到一定的指导作用。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。具体实施方式本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术为一种用于创伤修复富含干细胞提取物的可降解生物膜的制备方法，该方法具体步骤如下：实施例1步骤(1)、于L-DMEM培养基中加入青霉素浓度为100U/mL、链霉素浓度为100U/mL，配制成骨髓间充质培养液；步骤(2)、无菌条件下，用步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液冲洗大鼠骨髓腔，将冲出的的骨髓加入至无菌培养瓶中，培养瓶中加入步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液，体积比为1:1，用无菌移液器充分吹散骨髓细胞，制得骨髓细胞悬液；步骤(3)、将步骤(2)中得到的骨髓细胞悬液以800r/min离心5min，弃上清液，得到骨髓干细胞群；步骤(4)、取步骤(4)中得到的骨髓干细胞群加入步骤(1)中制得的培养液中重悬后用70μm无菌尼龙过滤器过滤，将过滤后含有骨髓干细胞群的培养液以1×109个/mL接种于5cm×5cm培养皿中，置于37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养；步骤(5)、原代培养24h后第一次换液，之后每3d换液一次，第三次换液12h后以1:2比例传代培养；步骤(6)、无菌条件下抽取健康大鼠全血后加入柠檬酸钠，3000g离心20min，吸取上层血浆与凝血酶1:1混合后均匀铺于无菌6孔板中，静置30min后即得到纤维蛋白膜；步骤(7)、取步骤(5)中培养的第三代骨髓间充质干细胞以1×105个/mL接种于铺有纤维蛋白膜的无菌6孔板中，置于37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养24h，制得骨髓间充质干细胞-纤维蛋白膜。实施例2步骤(1)、于L-DMEM培养基中加入青霉素浓度为100U/mL、链霉素浓度为100U/mL，配制成骨髓间充质培养液；步骤(2)、无菌条件下，用步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液冲洗大鼠骨髓腔，将冲出的的骨髓加入至无菌培养瓶中，培养瓶中加入步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液，体积比为1:1，用无菌移液器充分吹散骨髓细胞，制得骨髓细胞悬液；步骤(3)、将步骤(2)中得到的骨髓细胞悬液以1500r/min离心10min，弃上清液，得到骨髓干细胞群；步骤(4)、取步骤(4)中得到的骨髓干细胞群加入步骤(1)中制得的培养液中重悬后用70μm无菌尼龙过滤器过滤，将过滤后含有骨髓干细胞群的培养液以1×109个/mL接种于5cm×5cm培养皿中，置于37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养；步骤(5)、原代培养48h后第一次换液，之后每3d换液一次，第三次换液18h后以1:2比例传代培养；步骤(6)、无菌条件下抽取健康大鼠全血后加入柠檬酸钠，3000g离心40min，吸取上层血浆与凝血酶1:1混合后均匀铺于无菌6孔板中，静置60min后即得到纤维蛋白膜；步骤(7)、取步骤(5)中培养的第三代骨髓间充质干细胞以1×105个/mL接种于铺有纤维蛋白膜的无菌6孔板中，置于37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养48h，制得骨髓间充质干细胞-纤维蛋白膜。实施例3步骤(1)、于L-DMEM培养基中加入青霉素浓度为100U/mL、链霉素浓度为100U/mL，配制成骨髓间充质培养液；步骤(2)、无菌条件下，用步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液冲洗大鼠骨髓腔，将冲出的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于创伤修复富含干细胞提取物的可降解生物膜的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：步骤(1)、于基础培养基中加入青霉素和链霉素，配制成骨髓间充质培养液；步骤(2)、无菌条件下将抽取的的骨髓与步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液混合后加入无菌培养瓶中，体积比为1:1，制得骨髓细胞悬液；步骤(3)、将所述步骤(2)中得到的骨髓细胞悬液离心后弃上清液，得到骨髓干细胞群；步骤(4)、取所述步骤(4)中得到的骨髓干细胞群加入所述步骤(1)中制得的骨髓间充质培养液中重悬后过滤，之后以1×109个/mL接种于培养皿中，置于培养箱中培养；步骤(5)、原代培养24‑48h后第一次换液，之后每3d换液一次，第三次换液12‑18h后以1:2比例传代培养；步骤(6)、无菌条件下于新鲜血浆中加入抗凝剂，离心后吸取上层血浆与凝血酶1:1混合后均匀铺于培养板中，静置后即得到纤维蛋白膜；步骤(7)、取步骤(5)中培养的第三代骨髓间充质干细胞以1×105个/mL接种于铺有纤维蛋白膜的培养板中，置于培养箱中培养，制得骨髓间充质干细胞‑纤维蛋白膜。

【技术特征摘要】
1.一种用于创伤修复富含干细胞提取物的可降解生物膜的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：步骤(1)、于基础培养基中加入青霉素和链霉素，配制成骨髓间充质培养液；步骤(2)、无菌条件下将抽取的的骨髓与步骤(1)中配置的骨髓间充质培养液混合后加入无菌培养瓶中，体积比为1:1，制得骨髓细胞悬液；步骤(3)、将所述步骤(2)中得到的骨髓细胞悬液离心后弃上清液，得到骨髓干细胞群；步骤(4)、取所述步骤(4)中得到的骨髓干细胞群加入所述步骤(1)中制得的骨髓间充质培养液中重悬后过滤，之后以1×109个/mL接种于培养皿中，置于培养箱中培养；步骤(5)、原代培养24-48h后第一次换液，之后每3d换液一次，第三次换液12-18h后以1:2比例传代培养；步骤(6)、无菌条件下于新鲜血浆中加入抗凝剂，离心后吸取上层血浆与凝血酶1:1混合后均匀铺于培养板中，静置后即得到纤维蛋白膜；步骤(7)、取步骤(5)中培养的第三代骨髓间充质干细胞以1×105个/mL接种于铺有纤维蛋白膜的培养板中，置于培养箱中培养，制得骨髓间充质干细胞-纤维蛋白膜。2.根据权利要求1所述的一种用于创伤修复富含干细胞提...

【专利技术属性】
技术研发人员：张正亮，
申请(专利权)人：安徽惠恩生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34