一种免疫球蛋白结合蛋白突变体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种免疫球蛋白结合蛋白突变体，通过对天然葡萄球菌蛋白A（SpA）的E结构域氨基酸进行定点突变而获得，与免疫球蛋白分子的除互补决定区（CDR）之外的其他区域结合，并将其制备成用于免疫球蛋白亲和层析的层析介质，用于免疫球蛋白的分离、纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，更具体地本专利技术涉及一种免疫球蛋白结合蛋白突变体及其应用。本专利技术涉及的一种免疫球蛋白结合蛋白突变体，通过对天然葡萄球菌蛋白A（SpA）的E结构域氨基酸进行定点突变而获得，与免疫球蛋白分子的除互补决定区（CDR）之外的其他区域结合，并将其制备成用于免疫球蛋白亲和层析的层析介质，用于免疫球蛋白的分离、纯化。
技术介绍
葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A，SpA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。1947年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中，能与正常人血清形成沉淀。Jensen（1959）也发现了类似现象，将其命名为A抗原。1963年Lofkvist等分离了A抗原，并证明它是一种蛋白质，且与糖有区别。Grov （1960）将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SpA蛋白A （ProteinA）。编码SpA的基因于1983年被克隆并在大肠杆菌中表达。对SPA结构和功能的研究发现，SpA分子包含A，B，C，D，E五个同源结构域，每个结构域都有能与IgG自主结合的能力。在中性pH条件下，蛋白A捕获免疫球蛋白分子，在低pH条件下将其释放出来。因此，以SpA作为配体的亲和层析已经成为目前分离、纯化治疗性单克隆抗体重要手段之一。蛋白A亲和层析是治疗性单克隆抗体下游纯化的第一步，待纯化的培养上清中含有大量生物大分子杂质，每次或数次纯化循环后，必须经过在位清洗，否则层析介质的性能将显著下降。为了延长层析柱的寿命和确保纯化质量，必须定期对层析柱进行在位清洗（CIP），最理想的CIP条件是使用0.5M的氢氧化钠溶液，以较低的流速清洗15-20分钟。但天然或重组的SpA配基对NaOH非常敏感，强碱性条件下易变性或脱落，如果选用高浓度的盐酸胍或尿素进行清洗，清洗的效果远远不如NaOH清洗效果好，而且清洗成本非常高，不适用于单克隆抗体的产业化生产。层析介质中蛋白A变性及脱落，是由于蛋白A在碱性条件下，天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）发生脱氨基反应，造成肽链断裂。易发生脱氨基的氨基酸中，天冬酰胺（Asn）比Gln对碱性条件更敏感。脱氨基反应速率最快的是当肽链中含有天冬酰胺（Asn）与甘氨酸（Gly）结合或天冬酰胺（Asn）和丝氨酸（Ser）结合的序列。由于“天冬酰胺-甘氨酸”序列对于碱性是最敏感的，SpA结构域中E含有“天冬酰胺-甘氨酸”序列（N28-G29），因此推测其耐碱性最差。目前的耐碱性SpA序列的突变主要集中在B、C结构域，如目前应用较广泛的耐碱性SpA亲和介质Mabselect SuRe，采用的是SpA结构域B进行天冬酰胺的定点突变，将第23位的天冬酰胺突变为苏氨酸（N23T）。此外，专利技术专利（申请号CN03806793.5）公开了，利用对SpA的结构域B 序列使用附近突变技术（“by pass”）进行定点突变（N23T，N43E），以提高其耐碱性。专利技术专利（申请号201310097553.9）公开了，利用SpA结构域B序列进行定点突变（N23T，F30A）以提高其耐碱性。此外，专利技术专利（申请号CN200780036281.4）公开了对结构域C序列野生型（Cwt）及缺失了“Asn-Lys-Phe-Asn”突变体（Cdel）获得了与MabselectSure相当的耐碱性。在单克隆抗体分离纯化过程中，目前使用的ProteinA介质存在着耐碱性差的问题。Protein A介质经过多次碱性清洗后，动态吸附载量下降、纯化效率降低。本专利技术通过对天然Protein A的E结构域进行定点突变E（N23T，N28D，G29A），该突变体与现有技术相比，其耐碱性、动态吸附载量及纯化效果等均显著提高。
技术实现思路
本专利技术涉及的一种免疫球蛋白结合蛋白突变体，其氨基酸序列来源于天然葡萄球菌蛋白A（SpA）的E结构域。通过对其氨基酸序列中“碱敏感”的天冬酰胺进行定点突变，使其突变体较亲本分子相比具有更高的耐碱性，且该突变体对免疫球蛋白的亲和力显著提高。本专利技术所述的一种免疫球蛋白结合蛋白突变体，利用天然葡萄球菌蛋白A的E结构域，将其E结构域中部分氨基酸进行突变，如N11S，N21A，N23T，N28D，N28A，G29A，N43E，N52A；及突变点的组合突变，如E（N23T，N28D），E（N23T，N28A），E（N23T，N43E），E（N28D，N43E），E（N32T，N28D，G29A）等。经过活性测试、耐碱性测试及亲和力测试等大量实验验证，其中优选实施例为将其第23位天冬酰胺突变为苏氨酸，第28位天冬酰胺突变为天冬氨酸，第29位甘氨酸突变为丙氨酸（N23T，N28D，G29A）。将优选的免疫球蛋白结合蛋白突变体利用基因工程技术发酵培养、分离纯化，获得具有较高免疫球蛋白亲和力、耐碱性强的免疫球蛋白结合蛋白分子，将该结合蛋白分子利用亲和层析介质制备方法制备成用于免疫球蛋白亲和层析的层析介质，该层析介质与现有市场化的层析介质相比，其耐碱性、动态吸附载量机纯化效果均显著提高。附图说明图1、BL21/pET32a上清液SDS-PAGE电泳图。图2、i Protein A与MabslectSure 性能比较图。具体实施方式实施例1、天然SpA的耐碱性突变点选择天然SpAD 耐碱性取决于其氨基酸序列，一般认为，在碱性条件下，发生在天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）的脱氨基反应是造成肽链断裂的重要原因。而且脱氨基反应速率最快的是当肽链中含有天冬酰胺（Asn）与甘氨酸（Gly）结合或天冬酰胺（Asn）和丝氨酸（Ser）结合的序列。而SpA与IgG的亲和力取决于多肽和蛋白质的构象。SpA不同结构域的氨基酸序列分析见下表1。表1、SpA不同结构域的氨基酸序列分析选取含天冬酰胺残基较少的E结构域作为突变模板，与以往SpA突变常用的“by pass”策略不同，对E结构域直接进行定点突变。突变目标氨基酸首选其他结构域相应位点的天然氨基酸（如Ser，Glu），若此位点不含天然氨基酸则选用丙氨酸（Ala）。 对于此前报道不适合定点突变的N28，使用与之结构类似的天冬氨酸进行代替。针对SpA结构域E的定点突变见下表2。表2、SpA结构域E的定点突变实施例2、含结构域E突变体的制备（1）含结构域E突变体的载体构建人工合成表1中的各种突变体基因序列。与经NcoI及BamHI酶切的载体pET32a连接，转化大肠杆菌（BL21/DE3），筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明结构域E突变体基因克隆至pET32a中。（2）含结构E突变体的菌种构建与发酵用CaCl2法将pET32a-P转化大肠杆菌BL21 /DE3，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pET32a的重组转化子（BL21/pET32a）。挑取大肠杆菌工程菌BL21 /pET32a，接种于LB培养基中，接种量1~2%V/V，于30℃培养过夜，次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按l: 10-1: 5接种于发酵培养基上，30℃发酵至OD600达到0.4~0.8，升温至42℃诱导，5小时后收离心收菌。取少量细胞加2X上样缓冲液，按标准做SDS-PA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合免疫球蛋白分子的结合蛋白突变体，其特征在于，将天然葡萄球菌蛋白A（SpA）的E结构域中部分氨基酸进行突变，所述突变选自N23T和/或N28D和/或G29A突变。

【技术特征摘要】
1.一种结合免疫球蛋白分子的结合蛋白突变体，其特征在于，将天然葡萄球菌蛋白A（SpA）的E结构域中部分氨基酸进行突变，所述突变选自N23T和/或N28D和/或G29A突变。2.权利要求1所述一种结合免疫球蛋白分子的结合蛋白突变体，其特征在于，所述免疫球蛋白分子结合蛋白突变体具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。3.一种突变蛋白四聚体，其特征在于，由权利要求1、2所述结合蛋白分子作为单元构成。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱卫珠，
申请(专利权)人：上海张江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31