基于DC的肾癌治疗性疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于DC的肾癌治疗性疫苗及其制备方法，制备方法包括以下步骤：分别获取未成熟DC和肾癌干细胞；对肾癌干细胞作灭活处理，获得灭活后的肾癌干细胞；将灭活后的肾癌干细胞与未成熟DC于DC培养基中进行共培养7～14天；再加入肿瘤坏死因子‑α继续培养2～4天，至DC成熟。通过采用灭活后的肾癌干细胞负载未成熟DC的方式获得的肾癌治疗性疫苗不仅性状较稳定，而且免疫原性及特异性较强，杀瘤能力较强，能够很好的调节机体免疫机制，有效改善肾癌引起的肾脏免疫耐受的现象。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及一种基于DC的肾癌治疗性疫苗及其制备方法。
技术介绍
肾癌亦称肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC),是最常见的肾脏实质性恶性肿瘤(约占90％),占全身恶性肿瘤的2％,位居泌尿生殖系统肿瘤的第二位(仅次于膀胱癌)。我国近20年来肾癌的发病率呈上升趋势，而且上升幅度在恶性肿瘤中排名第一。肾癌起病隐匿，往往缺乏早期临床表现，大约30％的肾癌患者在诊断时已经发生转移，同时在行根治性切除术后的肾癌中也有20％-30％会发生转移。肾癌对放疗、化疗、细胞因子治疗效果不佳，转移性肾癌患者的5年生存率只有12％。因此，晚期肾癌治疗迫切需要更加有效的新型治疗方案。由于肾癌是一种免疫原性很强的肿瘤,所以对晚期肾癌的治疗上免疫治疗有其独特的优势。目前现有技术中，普遍采用DC-肿瘤细胞融合疫苗，该种方法制备的DC治疗性疫苗有许多缺陷，如：由于肿瘤细胞携带的抗原信息相对于携带肾癌全面抗原信息的多种肾癌细胞分秘释放到细胞外的基质来说不够完善且全面，因此导致了引发的免疫反应较弱，杀瘤能力不强等问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中肾癌疫苗存在免疫反应弱、杀瘤能力差等缺陷，提供一种免疫原性及特异性强的基于DC的肾癌治疗性疫苗及其制备方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：分别获取未成熟DC和肾癌干细胞；对所述肾癌干细胞作灭活处理，获得灭活后的肾癌干细胞；将所述灭活后的肾癌干细胞与未成熟DC于DC培养基中进行共培养7～14天；再加入肿瘤坏死因子-α继续培养2～4天，至DC成熟。在本专利技术提供的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法中，所述DC培养基为含有700～900U/mL粒-巨噬细胞因子和800～1200U/mL白介素-4的基础培养基。在本专利技术提供的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因子-α的终浓度为800～1200U/mL。在本专利技术提供的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法中，所述DC的浓度为(2～5)×105个/ml。在本专利技术提供的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法中，所述未成熟DC的获取过程包括以下步骤：取外周血，稀释后加入淋巴细胞分离液和抗凝血，离心后取白色浑浊层液体，将所述白色浑浊层离心后弃上清，即分离出单个核细胞，对单个核细胞进行体外培养1～3小时，收集贴壁细胞，即CD14+单核细胞；然后将所述CD14+单核细胞于体外诱导培养液中诱导分化成未成熟DC。在本专利技术提供的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法中，所述体外诱导培养液为含有5％～15％胎牛血清、700～900U/mL粒-巨噬细胞和800～1200U/mL白介素-4的基础培养基。在本专利技术提供的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法中，所述肾癌干细胞的获取过程，包括以下步骤：取对数生长期的肾癌细胞，用无血清培养基重悬后，加入5-氟尿嘧啶，处理12～24小时后，去除5-氟尿嘧啶，再加入所述无血清培养基，置于3～5％O2条件下培养3～5天，至收获细胞球，用细胞消化液消化后，即获得原代肾癌干细胞；其中，所述无血清培养基中含有碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子，以及含有B27的DMEM/F 12培养基。在本专利技术提供的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法中，所述无血清培养基中，碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10～30ng/ml，表皮细胞生长因子的终浓度为10～30ng/ml，B27与DMEM/F 12培养基的体积比为1：(40～60)。在本专利技术提供的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法中，还包括对所述原代肾癌干细胞进行传代培养的步骤，且所述肾癌干细胞为第3～5代任一代肾癌干细胞。本专利技术还提供一种基于DC的肾癌治疗性疫苗，由上述基于DC的肾癌治疗性疫苗制备方法所获得的。实施本专利技术提供的基于DC的肾癌治疗性疫苗及其制备方法，可以达到以下有益效果：通过采用灭活后的肾癌干细胞负载未成熟DC的方式获得的肾癌治疗性疫苗不仅性状较稳定，而且免疫原性及特异性较强，杀瘤能力较强，能够很好的调节机体免疫机制，有效改善肾癌引起的肾脏免疫耐受的现象。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供的一种基于DC的肾癌治疗性疫苗，其制备方法包括以下步骤：S1、获取未成熟DC；S2、获取肾癌干细胞，并对肾癌干细胞作灭活处理，获得灭活后的肾癌干细胞；S3、将步骤S1获得的未成熟DC和步骤S2中获得的灭活后的肾癌干细胞于DC培养基中进行体外共培养7～14天，再加入肿瘤坏死因子-α继续培养2～4天，至DC成熟且已负载有肾癌干细胞抗原物。具体地，步骤S1中，未成熟DC可来源于人体血液，但由于未成熟DC在血液中仅占单核细胞总数的0.5-1.0％，数量很少；因此，本专利技术优选实施例中，采取诱导单核细胞的方式获取未成熟DC，具体步骤为：S11、从外周血中分离出单核细胞；S12、再加入体外诱导培养基培养对步骤S11中获得的单核细胞进行体外扩增培养；S13、用体外诱导培养液进行半量换液，并将步骤S12中扩增后的单核细胞定向诱导分化成未成熟的树突状细胞。在步骤S11中，单核细胞可以为CD34+和/或CD14+单核细胞，其中，CD34+单核细胞可以从骨髓、脐带血或脾脏等分离得到；CD14+细胞从人外周血分离得到的。由于从脐带血中纯化出CD34+单核细胞费用昂贵；骨髓采集不易，而且容易污染，患者比较痛苦，扩增费用昂贵；而脾脏来源受限等使得CD34+单核细胞获取较困难；因此，在本专利技术中，优选采用从人外周新鲜血液中分离筛选出CD14+单核细胞，从新鲜血液中获取，相比经过冷库储存或者培养传代之后的CD14+单核细胞，从新鲜血液中提取的CD14+单核细胞离体时间不长，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更有利于获取DC。CD14+单核细胞从人外周血分离的过程为：取人外周血，稀释后，加入淋巴细胞分离液，之后再加入抗凝血，离心后取白色浑浊层，离心后弃上清，即可分离出单个核细胞，对单个核细胞进行体外培养1～3小时，收集贴壁细胞即为CD14+单核细胞。步骤S12和步骤S13中的体外诱导培养液优选为适宜于DC生长的含5％～15％胎牛血清、700～900U/mL粒-巨噬细胞和800～1200U/mL白介素-4的基础培养基。需要特别注意的是，由于DC相比非贴壁细胞其能具有贴壁性，但是其贴壁性能并不强，而是偏向于半贴壁的类型，因此在步骤S13中单个核细胞的培养过程中需采用半量换液，以避免将目的DC吹成悬浮而流失。当然可以理解的是，本专利技术获得未成熟DC的途径也并不局限于此，通过其他诱导方法诱导单核细胞获得的未成熟DC同样适用于本专利技术。具体地，步骤S2中，肾癌干细胞的获取过程包括以下步骤：S21、复苏培养肾癌细胞；本专利技术所采用的肾癌细胞为人肾透明细胞癌786-O细胞株，购自于上海中国科学院上海细胞生物学研究所。优选地，本专利技术采用水浴加热的方式至人肾透明细胞癌786-O细胞株融化，再加入含有青霉素和链霉素的基础本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：分别获取未成熟DC和肾癌干细胞；对所述肾癌干细胞作灭活处理，获得灭活后的肾癌干细胞；将所述灭活后的肾癌干细胞与未成熟DC于DC培养基中进行共培养7～14天；再加入肿瘤坏死因子‑α继续培养2～4天，至DC成熟。

【技术特征摘要】
1.一种基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：分别获取未成熟DC和肾癌干细胞；对所述肾癌干细胞作灭活处理，获得灭活后的肾癌干细胞；将所述灭活后的肾癌干细胞与未成熟DC于DC培养基中进行共培养7～14天；再加入肿瘤坏死因子-α继续培养2～4天，至DC成熟。2.根据权利要求1所述的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述DC培养基为含有700～900U/mL粒-巨噬细胞因子和800～1200U/mL白介素-4的基础培养基。3.根据权利要求1所述的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述肿瘤坏死因子-α的终浓度为800～1200U/mL。4.根据权利要求1所述的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述DC的浓度为(2～5)×105个/ml。5.根据权利要求4所述的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制备方法，其特征在于，所述未成熟DC的获取过程包括以下步骤：取外周血，稀释后加入淋巴细胞分离液和抗凝血，离心后取白色浑浊层液体，将所述白色浑浊层离心后弃上清，即分离出单个核细胞，对单个核细胞进行体外培养1～3小时，收集贴壁细胞，即CD14+单核细胞；然后将所述CD14+单核细胞于体外诱导培养液中诱导分化成未成熟DC。6.根据权利要求5所述的基于DC的肾癌治疗性疫苗的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，董慧君，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44