一种美洲黑杨伸展蛋白基因及其编码蛋白与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种美洲黑杨伸展蛋白基因及其编码蛋白与应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术利用PdEXT基因和植物维管组织特异启动子proNAC068载体构建了融合表达载体，获得了转基因植物。针对其木材品质性状的测试表明，该基因的转入可以有效改良树木的材性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地说，本专利技术涉及一种来源于速生且木材品质优良的美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)的伸展蛋白基因，命名为PdEXT。本专利技术还涉及PdEXT基因编码的蛋白，利用PdEXT基因和植物维管组织特异启动子proNAC068载体构建的融合表达载体，以及利用该基因培育优良木材品质的转基因杨树的方法。
技术介绍
杨树在我国是一个栽培历史悠久、种类繁多、分布广泛的重要经济树种以及重要的短轮伐期工业用材树种之一，杨树材性的育种一直是林木育种工作的重点。2002年毛果杨基因组测序工作的顺利完成，促进了树木基因分离和应用的研究。一些与木材性状相关基因的陆续被发现、克隆和验证，为从基因水平上改善林木材性提供了基础。伸展蛋白(Extensin)是第一个被鉴定作为细胞壁的疏松蛋白，参与胞壁多聚糖的伸展作用，具有能在植物体外诱导细胞壁扩展，导致细胞壁松弛、细胞膨大的功能。伸展蛋白或细胞壁松弛蛋白是植物细胞壁的重要的糖蛋白，其羟脯氨酸(Hyp)含量比例高，两者呈正相关关系。根据结构和功能分析，细胞壁松弛蛋白expansin可分为α、β、γ和δ四个亚家族，它们可能来源于共同的祖先。过量表达和反义RNA干涉试验表明，通过内源导入expansin基因与外源施用expansin蛋白导致细胞壁变化和细胞的生长趋势类似。已有研究表明，expansin的表达具有细胞、组织和器官的特异性，expansin在次生木质部有高丰度的表达，expansin基因与营养生长、根系发生、果实成熟、授粉受精等生理活动密切相关，调节植物细胞生长和发育。由上可知，研究伸展蛋白对改善杨树木材性状具有重要的意义。然而，目前对美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)伸展蛋白基因还未见相关的研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的一个目的是提供一种具有有效改良树木材性的基因美洲黑杨伸展蛋白基因-PdEXT。通过对该基因的应用，有利于改良木材的品质，提高以该木材为原料生产的产品的质量。本专利技术提供了一种美洲黑杨伸展蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本专利技术还提供了一种基于上述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本专利技术还提供了一种表达载体，包含上述美洲黑杨伸展蛋白基因。优选地，所述表达载体包含维管组织特异启动子proNAC068。本专利技术还提供了一种细胞，所述细胞为将宿主细胞转化后的包含上述表达载体的细胞。优选地，所述宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌或农杆菌细胞。本专利技术还提供了一种包含上述美洲黑杨伸展蛋白基因的表达载体的构建方法，包括如下步骤：A、克隆美洲黑杨伸展蛋白基因；B、将步骤A所述的基因连接到pGEM-T Easy载体中，得到连接产物PGEM-PdEXT；C、将步骤B所得的连接产物PGEM-PdEXT和维管组织特异启动子proNAC068载体分别进行Xba I和Sac I双酶切后，连接得到一个双元表达载体；D、将所述双元表达载体转化到农杆菌GV3101感受态细胞中。本专利技术还提供了一种利用美洲黑杨伸展蛋白基因获得转基因山新杨植株的方法，包括以下步骤：构建包含权利要求1所述基因的表达载体；用所述构建的表达载体转化山新杨细胞；将所述转化的山新杨细胞培育成转基因山新杨植株。本专利技术还提供了一种基于美洲黑杨伸展蛋白基因转化植物获得转基因植物的应用，其特征在于，当所述植物为单子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：水稻、小麦、玉米、牧草；当所述植物为双子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：杨树、拟南芥、烟草、油菜。综上所述，本专利技术提供一种具有有效改良树木材性的基因PdEXT。通过对该基因的应用，有利于增强木材的强度，提高以该木材为原料生产的产品的质量。附图说明图1.PdEXT植物表达载体pBI121-proNAC068-PdEXT构建图；图2.农杆菌转染PdEXT的杨树分化出的丛生芽；图3.转入生根培养基的PdEXT转基因杨树植株；图4.移栽的PdEXT转基因山新杨植株和对照植株；图5.PdEXT转基因山新杨植株的PCR检测；图6.PdEXT转基因山新杨及其对照植株的PdEXT和木材微纤丝角相关基因的荧光实时定量PCR分析；图7.PdEXT转基因山新杨及其对照植株的茎横切面解剖特征和微纤丝角汇总图；图8.PdEXT转基因山新杨及其对照植株的茎横切面解剖结构。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例中所用试剂如下：RQ-Dnase(Promega，美国)、RNase Inhibitor(Promega，美国)、MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)、dNTP(天根，中国)、Plant TotalRNA Isolation Kit(Autolabtech，中国)、MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)试剂盒、pGEM-T Easy试剂盒(Promega，美国)、水饱和酚(Autolabtech，中国)、氯仿(北京化工，中国)。以下，对本文的实施方式进行具体说明。实施例1、美洲黑杨PdEXT基因的克隆从中国林科院的美洲黑杨未成熟木质部和木质部组织中提取总RNA。总RNA的提取采用奥莱博生物技术有限公司(Autolabtech，中国)生产的植物总RNA提取试剂盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具体操作过程参照其说明书。总RNA提取后，用RNase-free DNase(Promega，上海)处理15分钟，酚/氯仿抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并利用MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)进行cDNA的反转录。选择树干通直、生长旺盛的15年生美洲黑杨成年树木，用钻子、斧头去除胸径处树皮，暴露韧皮部组织，形成层和未成熟木质部等组织，用刮纸刀刮取未成熟木质部和木质部于液氮速冻后，保存于-80℃超低温冰箱。总RNA的提取采用奥莱博生物技术有限公司(Autolabtech，中国)生产的植物总RNA提取试剂盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具体操作过程参照其说明书。总RNA提取后，用RNase-free DNase(Promega，美国)处理15min，氯仿/酚抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。以带Oligo(dT)15的引物，利用MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)进行反转录获得cDNA。Oligo(dT)15引物序列如下：TTTTTTTTTTTTTTT反转录反应如下1、RNA样品2～6μl(0.05～1μl)，加入CDS PrimerⅡA Oligo(dT)15-30 2μl，加水补足到总体积10μl，混合并短暂离心。2、72℃温育2min，立即置于冰上2min，并短暂离心。用PCR仪72℃温育2.5min。3、加入下列成份：4μl 5×First-Strand Buffer本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种美洲黑杨伸展蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种美洲黑杨伸展蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种基于权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的基因。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包含维管组织特异启动子proNAC068。5.一种细胞，其特征在于，所述细胞为将宿主细胞转化后的包含权利要求3所述的表达载体的细胞。6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌或农杆菌细胞。7.一种基于权利要求4所述表达载体的构建方法，包括如下步骤：A、制备如权利要求1所述的基因；B、将步骤A所述的基因连接到pGEM-T Easy载体中，得到连接产物PG...

【专利技术属性】
技术研发人员：李少锋，苏晓华，张冰玉，褚延广，刘学，孙丽芳，莫文娟，边星辰，高旭，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院华北林业实验中心，
类型：发明
国别省市：北京;11