一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，含以下步骤：(1)确定蜡样芽孢杆菌JZBC1的发酵罐培养发酵培养基；(2)种子液培养：选取蜡样芽孢杆菌JZBC1，进行活化培养，获得发酵种子液；(3)工业化发酵罐培养：按50L—500L—5000L发酵罐规模，将发酵种子液接入发酵培养基中逐级扩大发酵，获得发酵液，(4)菌泥后处理与包装：采用离心机除去发酵液中的多余水分，获得菌泥，将菌泥与载体混匀，经含干燥、粉碎和包装工序处理后，获得蜡样芽孢杆菌JZBC1制剂。该方法通过研究蜡样芽孢杆菌JZBC1的发酵培养基和发酵参数，建立了将菌剂从菌种到产品的工业化规模生产的相关工艺。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物制剂
，具体涉及一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法。
技术介绍
近年来水域环境的甲藻赤潮频发，养殖水源环境的污染日趋恶化，这严重影响了池塘养殖生产的健康发展。有研究表明当池塘水体形成以甲藻、蓝藻等有害微藻为优势时，养殖水质恶化，养殖对虾的生长和健康水平受到严重影响(刘孝竹,2011)；当甲藻浓度升高到104cells/L时，致使对虾行为异常并逐渐死亡(Linares,2009)。而南方海水或咸淡水池塘在养殖前中期容易形成以甲藻为优势的微藻群落结构，在此环境下养殖对虾极易发生病害，严重影响了养殖效益(彭聪聪,2011；刘孝竹,2009)。所以，严格控制甲藻的生态优势，稳定养护以绿藻或硅藻为优势的微藻环境，对保障池塘养殖生产顺利开展具有重要的现实意义。目前在甲藻防控领域的研究主要集中在对海湾赤潮(Mayali,2007；Rooney,2005)及相关有害藻特性与治理(谢志浩,2008)，以及相应溶藻菌的分离筛选与溶藻机制分析等(Yang et al,2013；Shi et al,2013)。养殖池塘环境与上述水环境差异巨大，有关利用溶藻菌防控池塘甲藻优势并维护优良微藻藻相的研究及应用还少见报道。近年来报道的微藻溶藻菌种类主要有：芽孢杆菌、海洋杆菌、屈挠细菌、假单胞菌、弧菌、噬胞菌、黄杆菌、节杆菌、葡萄球菌、鞘氨醇单胞菌等。史荣君(2013)、Yang(2013)等从赤潮环境中筛选了可有效溶解赤潮硅藻和甲藻的溶藻菌菌株，它们属于芽孢杆菌、海洋杆菌等多个菌种。本申请中的溶藻菌株JZBC1为蜡样芽孢杆菌(保藏名称为蜡样芽孢杆菌JZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2016年3月3日，保藏号：CCTCC M 2016081，申请号：201610209371.X)，它仅对池塘优势甲藻——锥状斯氏藻具有溶解消除作用，对小球藻、栅藻、小环藻等优良绿藻和硅藻无不良影响。蜡样芽孢杆菌广泛存在于环境中，为革兰氏阳性菌，其非毒性菌株可净化养殖水质，促进养殖生物健康生长，已被应用于医药、农业生产等领域(李煜等，2012；李侠等，2001)。曹煜成等在养殖池塘施用蜡样芽孢杆菌CZBC1菌剂，有效控制了颤藻、微囊藻等有害蓝藻，而对养殖对虾和水体其他优良绿藻和硅藻没有影响(曹煜成等，ZL201310 203745.3)；阳钢等使用蜡样芽孢杆菌BC-1有效提高了刺参的生长速度(阳钢等，2012)；何鉴尧等研究发现蜡样芽孢杆菌L7和L8对螺旋鞘丝藻有显著地控制效果(何鉴尧等，2008)。王善龙研究指出虽然对虾养殖水体中也存在蜡样芽孢杆菌，但只有施用了蜡样芽孢杆菌CZBC1的养殖水环境中的蓝藻数量才得到有效控制(王善龙，2015)。可见，即使是同属于蜡样芽孢杆菌，但不同来源的菌株其生态功能特性存在较大的差异。虽然就芽孢杆菌发酵工艺、溶藻菌发酵条件优化等已有报道(王海云等，一株蜡样芽胞杆菌及其制备方法应用，申请号201410223612.7；朱杰等，芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用，申请号201210308126.6；孙梅等，一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用，申请号201310413693.2；荣小军等，一种蜡样芽孢杆菌及其制剂和应用，申请号201010602326.3；叶姜瑜等，响应曲面法优化溶藻细菌发酵条件的研究，2011；许珂等，溶藻细菌W5培养条件优化及发酵培养)。但目前针对蜡样芽孢杆菌JZBC1菌剂的工业化发酵生产方法还未见报道。由于蜡样芽孢杆菌不是所有菌株都具有溶解池塘甲藻的特性，而上述研究中的溶藻菌也非本申请中的蜡样芽孢杆菌或类似的溶藻菌株，也未见相关菌剂的工业化生产产品。所以，本申请拟在溶解池塘优势甲藻—锥状斯氏藻的蜡样芽孢杆菌菌株JZBC1的工业化液体发酵方法方面进行研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，该方法通过研究蜡样芽孢杆菌JZBC1的发酵培养基和发酵参数，建立了将菌剂从菌种到产品的工业化规模生产的相关工艺。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，包括以下步骤：(1)确定蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化发酵罐培养的发酵培养基；(2)种子液培养：选取蜡样芽孢杆菌JZBC1，在恒温振荡条件下进行活化培养，获得发酵种子液；(3)工业化发酵罐培养：依照50L—500L—5000L的发酵罐规模，将发酵种子液接入发酵培养基中逐级进行扩大发酵，获得发酵液，其中，50L和500L发酵罐的发酵菌浓度均达到5.0×108～109cfu/mL以上，5000L发酵罐的最终菌浓度达到5.0×109～1010cfu/mL以上，芽孢获得率90～95％以上；(4)菌泥后处理与包装：采用离心机除去步骤(3)所得发酵液中的多余水分，获得菌泥，将菌泥与载体混匀，经包括干燥、粉碎和包装工序处理后，获得溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1制剂。在上述溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法中：步骤(1)中所述的发酵培养基为：1L水中含有玉米浆18.5～24.5g、大豆蛋白12～20g、NaCl 0.8～1.5g、KH2PO4 0.15～0.4g、MgSO4 0.15～0.4g、CaCl2 0.1～0.3g、质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL。进一步的，步骤(1)中所述的发酵培养基为：1L水中含有玉米浆20g、大豆蛋白13.5g、NaCl 1g、KH2PO4 0.2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.1g，质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL。在此条件下菌株的生长、芽孢形成率和发酵菌体的甲藻溶藻效率最佳。步骤(2)中的蜡样芽孢杆菌JZBC1，该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏名称为蜡样芽孢杆菌JZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2016年3月3日，保藏编号：CCTCC No：M 2016081。具体内容可参阅申请号为201610209371.X的专利申请。步骤(2)在恒温振荡条件下进行活化培养时，活化培养基为营养肉汤培养基(优选是营养肉汤液体培养基，市售产品，本申请购自广东环凯微生物科技有限公司，此处仅为列举，并非限定)，培养条件优选为：pH 6.00～7.50，170～240rpm，28～32℃恒温振荡培养18～30h。步骤(3)中各发酵罐使用前经灭菌处理，发酵培养基的体积占各发酵罐总容积的60～75％。灭菌处理时，优选开启加热设备对发酵罐及管道系统进行灭菌(温度121℃，时间18～24min)，待罐体冷却至28～30℃，在50L发酵罐中接种入JZBC1发酵种子液。步骤(3)中首先将发酵种子液接种入50L发酵罐中，发酵种子液的接种量占发酵培养基总体积的2.5～5.5％，再依照50L发酵罐—500L发酵罐—5000L发酵罐的流程，进行逐级放大发酵，发酵条件为pH 6.8～7.5，温度28～32℃，转速450～700rpm，通气量20～60L/min，发酵培养16～28h。每级发酵时的条件均保持基本一致。其中500L发酵罐发酵时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，其特征是包括以下步骤：(1)确定蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化发酵罐培养的发酵培养基；(2)种子液培养：选取蜡样芽孢杆菌JZBC1，在恒温振荡条件下进行活化培养，获得发酵种子液；(3)工业化发酵罐培养：依照50L—500L—5000L的发酵罐规模，将发酵种子液接入发酵培养基中逐级进行扩大发酵，获得发酵液，其中，50L和500L发酵罐的发酵菌浓度均达到5.0×108～109cfu/mL以上，5000L发酵罐的最终菌浓度达到5.0×109～1010cfu/mL以上，芽孢获得率90～95％以上；(4)菌泥后处理与包装：采用离心机除去步骤(3)所得发酵液中的多余水分，获得菌泥，将菌泥与载体混匀，经包括干燥、粉碎和包装工序处理后，获得溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1制剂。

【技术特征摘要】
1.一种溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，其特征是包括以下步骤：(1)确定蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化发酵罐培养的发酵培养基；(2)种子液培养：选取蜡样芽孢杆菌JZBC1，在恒温振荡条件下进行活化培养，获得发酵种子液；(3)工业化发酵罐培养：依照50L—500L—5000L的发酵罐规模，将发酵种子液接入发酵培养基中逐级进行扩大发酵，获得发酵液，其中，50L和500L发酵罐的发酵菌浓度均达到5.0×108～109cfu/mL以上，5000L发酵罐的最终菌浓度达到5.0×109～1010cfu/mL以上，芽孢获得率90～95％以上；(4)菌泥后处理与包装：采用离心机除去步骤(3)所得发酵液中的多余水分，获得菌泥，将菌泥与载体混匀，经包括干燥、粉碎和包装工序处理后，获得溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1制剂。2.根据权利要求1所述的溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，其特征是：步骤(1)中所述的发酵培养基为：1L水中含有玉米浆18.5～24.5g、大豆蛋白12～20g、NaCl 0.8～1.5g、KH2PO4 0.15～0.4g、MgSO4 0.15～0.4g、CaCl2 0.1～0.3g、质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL。3.根据权利要求2所述的溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，其特征是：步骤(1)中所述的发酵培养基为：1L水中含有玉米浆20g、大豆蛋白13.5g、NaCl 1g、KH2PO4 0.2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.1g，质量百分含量为3％的MnSO4溶液1mL。4.根据权利要求1所述的溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，其特征是：步骤(2)在恒温振荡条件下进行活化培养时，活化培养基为营养肉汤培养基，培养条件为：pH 6.00～7.50，170～240rpm，28～32℃恒温振荡培养18～30h。5.根据权利要求1所述的溶解池塘甲藻的蜡样芽孢杆菌JZBC1的工业化液体发酵方法，其特征是：步骤(3)中各发酵罐使用前经灭菌处理，发酵培养基的体积占各发酵罐总容积的60～75％。6.根据权利要求1所述的溶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹煜成，文国樑，李卓佳，胡晓娟，李莎莎，杨铿，徐创文，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，潮州市正诚农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44