牛奶中青霉素药物的表面增强拉曼检测方法技术

牛奶中青霉素药物的表面增强拉曼检测方法，本发明专利技术涉及牛奶中青霉素药物的检测方法。本发明专利技术提供一种牛奶中青霉素药物的表面增强拉曼检测方法。本方法：一、制备具有SERS活性的银纳米粒子溶胶，然后利用层层自组装技术在玻璃基片上制备Ag NPs组装基底；二、将待测牛奶样品用有机物/水混合溶剂处理，得到待测牛奶样品上清液；三、将组装Ag NPs的玻璃基片放到待测牛奶样品上清液中浸渍，取出晾干，得到待测牛奶样品检测片；四、用拉曼光谱仪测试步骤三得到的待测牛奶样品检测片的表面增强拉曼光谱，将该光谱与青霉素药物标准品的拉曼图谱比对，实现对牛奶中青霉素药物的定性检测，定性检出限低至10‑7mol/L。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及牛奶中青霉素药物的检测方法。
技术介绍
青霉素属于β-内酰胺类抗生素药物，是治疗各种细菌感染性疾病使用最广泛且高效的抗菌药物之一，在人类的疾病治疗和畜牧业养殖方面大量使用。然而，抗生素的滥用现象却普遍存在，青霉素的滥用可以引起严重的过敏反应和细菌耐药性，甚至造成人的死亡。在畜牧养殖方面，青霉素药物常常被用来预防和治疗奶牛乳腺炎等疾病，因此在牛奶中会有青霉素残留，对人类健康构成了潜在的危害。为了确保食品安全，开展食品中痕量青霉素药物分子残留的检测研究是十分必要的，特别是牛奶中青霉素药物分子的检测。从传统意义上讲，牛奶中青霉素药物残留的分析方法主要有高效液相色谱法、生物传感器法及荧光偏振分析法等。但是这些方法却存在一些局限性。在2002年第468期的《分析化学》(Analytica Chmica Acta)的文章《一种基于羧肽酶活性抑制的生物传感器法定量检测牛奶中的青霉素G》(Biosensor analysis of penicillin G in milk based on the inhibition of carboxypeptidase activity)公开了一种检测牛奶中的青霉素G的方法。该方法利用的是具有羧肽酶活性的微生物受体蛋白作为探针分子，选择性地检测牛奶中具有活性、完整β-内酰胺环结构的青霉素G抗生素药物。他们采用表面活性剂P-20及胺偶联试剂盒对牛奶样品进行纯化处理，其中使用多克隆抗体(R513)作为生物传感器的特异性识别抗体对牛奶中的青霉素G(抗原)进行选择性定量检测。通过这一技术，牛奶中青霉素G药物的检出限可以达到2.6μg kg-1。这种检测方法的缺点在于不仅生物样品制备过程复杂且不易保存，而且样品前处理成本高且检测时间过长。2013年第141期的《食品化学》(Food Chemistry)报道了一种基于高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-DAD)同步检测绵羊奶中的九种抗生素药物的方法(An HPLC-DAD method for the simultaneous determination of nineβ-lactam antibiotics in ewe milk)，包括青霉素G、氨苄西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢哌酮、氯唑西林、双氯西林、苯唑西林及青霉素V。其中抗生素残留的提取方法是通过乙腈离心和固相萃取(SPE)及0.45μm微孔滤膜过滤过程对绵羊奶样品中的蛋白质进行纯化处理的。所有这些化合物的定量限(LOQs)均在3.4～8.6μg kg-1范围。这种检测方法的缺点在于实验操作过程复杂，样品前处理过程耗时且检测成本高，大大限制了它在实际分析领域中的应用。2014年第7期的《美国奶业协会》(American Dairy Science Association)的文章《利用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术对牛奶中青霉素类药物降解副产物的研究》(Research on degradation of penicillins in milk byβ-lactamase using ultra-performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectromety)，公开了采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术在β-内酰胺酶存在下通过研究牛奶中青霉素类药物(包括青霉素G、青霉素V及氨苄青霉素)的降解副产物反过来定性分析牛奶中含有的青霉素类药物的方法。该方法中加标牛奶样品的预处理操作如下：通过向2mL加标牛奶样品中直接添加10mL乙腈：水(v/v，3:1)混合液，在3050×g下离心10min，取出上清液在40℃氮气流下进行干燥得到固体残余物，再将所获得的残余物溶解于2mL纯化水中并使用0.45和0.22μm的混合纤维树脂微孔滤膜进行过滤。经预处理后方可进行下一步的检测操作；预处理操作主要是为了去除牛奶中的蛋白质等大分子干扰物质。这种检测方法的缺点在于不仅不能进行定量分析，而且操作步骤繁琐、分析检测时间长且成本高。2016年第190期的《食品化学》(Food Chemistry)的文章《利用荧光偏振方法检测牛奶中青霉素G的方法》(A novel fluorescence polarization assay for determination of penicillin G in milk)报道了一种基于青霉素G与适当红色染料共轭标记生产的青霉素抗体(生物传感器)定量检测牛奶中痕量青霉素G的荧光偏振分析法。他们利用纯化试剂盒对牛奶样品进行预处理，使用羊抗兔多克隆抗体(二次抗体)作为牛奶中青霉素G药物(抗原)的特异性识别抗体。该文献所提出的荧光偏振分析方法可以直接用于牛奶中青霉素G的检测而不受牛奶中其他物质的干扰。通过这种方法，其检出限可以达到1nmol/L，这要比欧盟(EU)规定的最大残留量12.0nmol/L少。这种检测方法利用纯化试剂盒进行前处理，使用辣根过氧化酶标记的羊抗兔多克隆抗体(二次抗体)构建生物传感器，实验成本大大增加。到目前为止，基于表面增强拉曼散射技术对牛奶中青霉素药物分子进行检测的研究尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种牛奶中青霉素药物的表面增强拉曼检测方法，克服现有技术的缺陷，填补SERS技术在牛奶中青霉素药物分子检测方面的空白，为牛奶中青霉素类药物分子及β-内酰胺类药物分子的分析检测提供新的思路。本专利技术的牛奶中青霉素药物的表面增强拉曼检测方法，按以下步骤进行：一、制备具有SERS活性的银纳米粒子(Ag NPs)溶胶，然后利用层层自组装技术在玻璃基片上制备Ag NPs组装基底；二、向待测牛奶样品中添加有机物/水混合溶剂，超声处理2～5min，再离心分离处理10～20min，移出上清液在室温下自然蒸发至干得到残余物；再向残余物中加入去离子水并超声处理2～5min，再离心分离处理5～10min，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜对上清液进行过滤，得到待测牛奶样品上清液；三、将组装Ag NPs的玻璃基片放到待测牛奶样品上清液中浸渍，然后将玻璃基片取出，用去离子水冲洗并自然晾干，得到待测牛奶样品检测片；四、用拉曼光谱仪测试步骤三得到的待测牛奶样品检测片的表面增强拉曼光谱，将该光谱与青霉素药物标准品的拉曼图谱比对，实现对待测牛奶样品中青霉素药物的定性检测。本专利技术将待测牛奶样品通过水辅助溶剂两步分离技术进行前处理，然后用组装Ag NPs玻璃基片浸渍，待测牛奶样品中的青霉素药物分子吸附在具有SERS活性的贵金属银纳米粒子(Ag NPs)基底上，产生可识别的拉曼光谱信号，通过与青霉素标准品的本体拉曼光谱比对，若牛奶样品中出现青霉素的特征SERS信号峰，即认定牛奶样品中有青霉素药物的存在，从而实现青霉素药物的定性和痕量检测；采用本方法不仅可以检测牛奶中残留的青霉素药物，通过与标准品的光谱比对，也可以实现对青霉素分解产物(如青霉噻唑酸、青霉酸等)进行定性鉴别。本专利技术首次将SERS技术应用于牛奶中青霉素药物的检测，采用水辅助溶剂两步分离技术去除牛奶中的大部分干扰物质，减少了干扰组分对SERS信号的抑制(或掩蔽)，提高了SERS检测的灵本文档来自技高网...

【技术保护点】
牛奶中青霉素药物的表面增强拉曼检测方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、制备具有SERS活性的银纳米粒子溶胶，然后利用层层自组装技术在玻璃基片上制备Ag NPs组装基底；二、向待测牛奶样品中添加有机物/水混合溶剂，超声处理2～5min，再离心分离处理10～20min，移出上清液在室温下自然蒸发至干得到残余物；再向残余物中加入去离子水并超声处理2～5min，再离心分离处理5～10min，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜对上清液进行过滤，得到待测牛奶样品上清液；三、将组装Ag NPs的玻璃基片放到待测牛奶样品上清液中浸渍，然后将玻璃基片取出，用去离子水冲洗并自然晾干，得到待测牛奶样品检测片；四、用拉曼光谱仪测试步骤三得到的待测牛奶样品检测片的表面增强拉曼光谱，将该光谱与青霉素药物标准品的拉曼图谱比对，实现对待测牛奶样品中青霉素药物的定性检测。

【技术特征摘要】
1.牛奶中青霉素药物的表面增强拉曼检测方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、制备具有SERS活性的银纳米粒子溶胶，然后利用层层自组装技术在玻璃基片上制备Ag NPs组装基底；二、向待测牛奶样品中添加有机物/水混合溶剂，超声处理2～5min，再离心分离处理10～20min，移出上清液在室温下自然蒸发至干得到残余物；再向残余物中加入去离子水并超声处理2～5min，再离心分离处理5～10min，移出上清液，依次用0.45μm和0.22μm的水系膜对上清液进行过滤，得到待测牛奶样品上清液；三、将组装Ag NPs的玻璃基片放到待测牛奶样品上清液中浸渍，然后将玻璃基片取出，用去离子水冲洗并自然晾干，得到待测牛奶样品检测片；四、用拉曼光谱仪测试步骤三得到的待测牛奶样品检测片的表面增强拉曼光谱，将该光谱与青霉素药物标准品的拉曼图谱比对，实现对待测牛奶样品中青霉素药物的定性检测。2.根据权利要求1所述的牛奶中青霉素药物的表面增强拉曼检测方法，其特征在于步骤一中制备具有SERS活性的银纳米粒子溶胶，然后利用层层自组装技术在玻璃基片上制备Ag NPs组装基底的具体步骤如下：a、将AgNO3加入到装有去离子水的三口烧瓶中，在磁力搅拌下加热使其溶解；继续加热，当溶液升温至98～100℃的沸腾状态时加入浓度为1％的柠檬酸钠水溶液，搅拌形成透明溶胶；透明溶胶在温度为93～97℃的微沸状态下保持50～60min，然后停止加热，自然冷却至室温，得到银溶胶；其中AgNO3的质量与浓度为1％的柠檬酸钠水溶液的体积的比是9mg：1mL；b、将干净玻璃基片先放在硫酸和双氧水的混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立滨，江欣，杜娟，李秀玲，张云杰，陈永亮，杨铭，张秀梅，
申请(专利权)人：佳木斯大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23