一种柔嫩梭菌及其培养方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种柔嫩梭菌及其培养方法与应用。所述的柔嫩梭菌从健康人的粪便中提取，其分类命名为柔嫩梭菌（clostridium leptum）L319，其保藏编号为GDMCC No：60042。本发明专利技术还提供了所述柔嫩梭菌（clostridium leptum）L319的培养方法的应用。本发明专利技术所提供的培养方法能够提高柔嫩梭菌的培养效率。所述柔嫩梭菌（clostridium leptum）L319酶活高，能够降解膳食纤维产生丁酸盐，本身可以诱导免疫抑制细胞Treg的产生，还可用于产氢气。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物领域中的一种柔嫩梭菌及其培养方法与应用。
技术介绍
柔嫩梭菌类群是人粪便菌群中数量最占优势的三大类群之一，而柔嫩梭菌作为该类群的优势菌，在肠道细菌中所占的比例约为16%±7%，能够从健康人的粪便中分离得到。作为益生菌，它对我们的人体健康发挥着重要的作用：第一，促进上皮细胞的生长与分化。柔嫩梭菌产生的丁酸，可最终代谢产生丁酸钠抑制结肠上皮细胞系的增殖、促进结肠上皮细胞系的分化。第二，促进食物的消化及营养代谢。柔嫩梭菌具有人体所不具备的酶（如纤维素酶），能够代谢宿主自身不能利用的非消化性碳水化合物，产生单糖或短链脂肪酸被人体所利用。第三，调节人体的免疫功能。柔嫩梭菌可以诱导免疫抑制细胞Treg，能够改善炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性肠炎，同时高效的治疗过敏性肺部炎症、气道炎症等，大大维持人体的免疫功能。第四，调节细菌的多样性，维持肠道细菌的稳态。第五，能够发酵产生乙酸和氢气，乙酸可用作酸度调节剂、酸化剂、腌渍剂、增味剂、香料等，同时也是很好的抗微生物剂，而氢气在工业和医学领域均有重要的用途。因此，对于人体的保健，柔嫩梭菌具有巨大的研究意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种柔嫩梭菌，该梭菌能够降解膳食纤维产生益生因子丁酸盐，梭菌本身可以诱导免疫抑制细胞Treg的产生。本专利技术所提供的梭菌，被鉴定为柔嫩梭菌（Clostridium leptum），来源于健康人体的粪便。所述柔嫩梭菌，其分类命名为柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），保藏编号为：GDMCC No：60042，保藏日期为：2016年5月25月。本专利技术所提供的柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319具有以下特征：1）菌落特征：菌落呈圆形，直径为0.2～0.5mm，呈白色，表面凸起，边缘光滑。2）细胞形态特征：细胞呈杆状，稍弯曲，近终端孢子很少，两端圆钝，细胞约为（1.3～2.8）×（0.6～0.8）μm；革兰氏染色呈阳性；。3）生理生化特征：专性厌氧生长；不水解明胶，不消化血清蛋白，能够代谢抗性淀粉、纤维素、半纤维素、胶质等多糖以及一些寡糖，由此产生的单糖或短链脂肪酸能够被宿主所利用。4)柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的16S rRNA基因序列长度为1278bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本专利技术的另一个目的是提供一种柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的培养方法。本专利技术所提供的柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的培养方法，是将柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319接种于RCM培养基，32℃~38℃，pH 6~8.5条件下厌氧培养。在1000 mL RCM液体培养基中含有：胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；余量为蒸馏水；RCM固体培养基是向上述RCM培养基中加入16g琼脂，蒸馏水定容至1000 mL。上述RCM培养基还包括氧化还原指示剂刃天青，其含量为0.5 g/L。本专利技术培养方法中，所需的厌氧环境是由80% N2、10% H2和10%CO2的混合气组成，一般注入达到1个大气压的量。本专利技术所提供的培养柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的方法，培养效率高，可达4.67×109 CFU/mL。本专利技术的柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319是从健康人体的粪便中分离得到的，是人体肠道的益生菌，在肠道菌类群上占有绝对优势，约占16%±7%。该梭菌可以降解膳食纤维产生人体所需的益生因子丁酸盐，丁酸盐对于人体的能量供应及肠上皮细胞的发育有重要作用，并在一定程度上抑制结肠癌的发生。另外，该梭菌还可以诱导免疫抑制细胞Treg，有效的治疗炎症及人体自身免疫性疾病。目前，就有研究通过口服柔嫩梭菌的方式来治疗小鼠的过敏性炎症、气道炎症。由此看来，柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319具有广阔的研究意义及背景。本专利技术所述的菌种，其分类命名为柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为：GDMCC No：60042，保藏日期为：2016年5月25日，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。实验中所使用的RCM液体培养基的基本组成为（/ 升）：胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；刃天青，0.5 mg；蒸馏水定容至1000 mL。实验中所使用的RCM固体培养基是向上述RCM液体培养基中加入16g琼脂，使其终浓度为1.6%。实施例1、菌株柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的分离制备取健康人体粪便的水解液，制备成悬菌液，后将其接种于以抗性淀粉为底物的RCM液体培养基中进行传代培养，得到富集物；将富集物作为接种源，将其接种于以纤维素为底物的RCM固体培养基，用Hungate滚管技术进行分离，最后得到纯化菌种。将其保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为：GDMCC No：60042，保藏日期为：2016年5月25日，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。实施例2、菌种鉴定一、形态及生理生化特征将柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319接种于以纤维素为底物的RCM固体培养基，在pH为7，温度为37 ℃，混合气为80% N2、10% H2和10%CO2的条件下进行厌氧培养72 h。观察菌落及细胞的形态特征，并进行如下生理生化实验：1 革兰氏染色试验；2液化明胶试验；3 血清蛋白试验；4 底物利用试验。观察结果及实验结果如下：1）菌落特征：菌落呈圆形，直径为0.2～0.5mm，呈白色，表面凸起，边缘光滑。2）细胞形态特征：细胞呈杆状，稍弯曲，近终端孢子很少，两端圆钝，细胞约为（1.3～2.8）×（0.6～0.8）μm；革兰氏染色呈阳性。3）生理生化特征：专性厌氧生长；不水解明胶，不消化血清蛋白，能够代谢抗性淀粉、纤维素、半纤维素、胶质等多糖以及一些寡糖，由此产生的单糖或短链脂肪酸能够被宿主所利用。二、柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定：1）提取DNA（参照TAKARA提基因组试剂盒）：将柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319接种于RCM液体培养基进行培养；通过测OD值，取生长至对数晚期的发酵液，12,000转/分钟离心5分钟，去除上清液；加入500 μL的Buffer BS重悬细胞，加入50 μL的Lysozyme（20 mg/mL），充分吸打混匀，于37 ℃水浴温育1小时（每隔20分钟颠倒混匀一次）；12,000 rpm离心5分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柔嫩梭菌，其特征在于，其分类命名为柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319，其保藏编号为GDMCC No：60042。

【技术特征摘要】
1.一种柔嫩梭菌，其特征在于，其分类命名为柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319，其保藏编号为GDMCC No：60042。2.权利要求1所述柔嫩梭菌的培养方法，其特征在于，将柔嫩梭菌（Clostridium leptum）L319接种于RCM培养基，32℃~38℃，pH 6~8.5条件下厌氧培养；所述RCM培养基以纤维素为底物；RCM液体培养基成分为：胰蛋白胨，10 g；牛肉膏，10 g；葡萄糖，5 g；氯化钠，5 g；酵母膏，3 g；乙酸钠，3 g；可溶性淀粉，1 g；L-半胱氨酸盐酸盐，0.5 g；蒸馏水定容至1000 mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：江凌，刘婷婷，吴茜，黄和，徐晴，李霜，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32