本发明专利技术公开了一种类病变基因UAP1的催化特性及其应用，类病变基因UAP1的催化特性为OsUAP1催化UDPG单向分解，不催化UDPG合成；OsUAP1点突变G280E使得酶活性降低；OsUAP1是UDPG代谢的关键酶之一。本发明专利技术发现类病变基因OsUAP1具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，能催化UDPG分解；氨基酸点突变OsUAP1G280E导致酶活性降低；OsUAP1是UDPG代谢的关键酶之一，且UDPG积累是诱发水稻叶片坏死斑点形成的重要因素，解决了OsUAP1蛋白是否具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性以及它与细胞程序化死亡导致植物类病变发生存在怎样的关系属于技术空白的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种类病变基因UAP1的催化特性及其应用。
技术介绍
植物类病变(lesion mimic,LM)又称类病斑，指在没有明显机械损伤、逆境和外界病原菌侵染，植物的局部(如叶片、叶鞘等)或整株上自发产生坏死斑点。这种现象普遍存在于植物界，玉米中最早报道了该表型的突变体，随后在大麦、拟南芥、水稻等植物中相继发现。突变体的表型与植物过敏反应中无毒病原菌侵染形成的病斑非常类似，都是通过局部细胞死亡诱发叶片发生肉眼可见的形态变异，属于程序性细胞死亡(PCD)。某些类病变突变体可以对不同的病菌表现出一定抗性，因此类病变突变体及其相关基因是阐释植物抗病性和PCD调控机制的理想材料。类病变发生的机制相当复杂，许多研究发现，植物代谢过程中某些关键酶发生突变，会直接或间接诱导植物类病变的发生。这些代谢途径主要涉及脂肪酸、氨基酸以及卟啉等。例如，中科院遗传与发育研究所李家洋课题组发现拟南芥MOD编码脂酰基载体蛋白还原酶(脂肪酸合成途径的关键酶之一)，该酶的点突变会导致催化活性显著下降，脂肪酸不能正常生物合成，造成总 脂生成量减少，造成拟南芥生长发育受到严重影响。此外，催化色胺羟基化的蛋白CYP71P1参与水稻类病变的发生。目前发现水稻尿苷二磷酸乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(OsUAP1)突变导致叶片上出现褐色斑点并过早衰老坏死。UAPase属于UDPGP(UDP-glucosepyrophosphorylase；PF01704)基因家族，在自然界中普遍存在，在将糖转化成核苷酸糖的代谢过程中发挥着关键性的作用，对维持生物体生长发育至关重要。UAPase具有较广泛的底物特异性，能催化UDP-GlcNAc合成及分解反应。但OsUAP1蛋白是否具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性以及它与水稻叶片细胞坏死产生类病斑并早衰之间存在怎样的关系，目前还鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种类病变基因UAP1的催化特性及其应用，旨在解决OsUAP1蛋白是否具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性以及它与植物叶片细胞坏死形成类病斑存在怎样的关系属于技术空白的问题。本专利技术是这样实现的，一种类病变基因UAP1，所述类病变基因UAP1的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。进一步，所述类病变基因UAP1的催化特性为OsUAP1催化UDPG单向分解，不催化UDPG合成；OsUAP1点突变G280E使得酶活性降低；OsUAP1是UDPG代谢的关键酶之一。本专利技术的另一目的在于提供一种所述的类病变基因UAP1在培育和改良抗早衰水稻品种中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种所述的类病变基因UAP1的在防治水稻叶片细胞坏死中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种所述的类病变基因UAP1的在延缓稻株衰老中的应用。本专利技术提供的类病变基因UAP1的催化特性及其应用，本专利技术中发现类病变基因OsUAP1具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，能催化UDPG分解；氨基酸点突变OsUAP1G280E导致酶活性降低；OsUAP1是UDPG代谢的关键酶之一，且UDPG积累是诱发水稻叶片坏死斑点形成类病变的一个重要因素，解决了OsUAP1蛋白除具有尿苷二磷酸乙酰葡糖胺焦磷酸化酶活性外，是否还具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，在尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)代谢中是否发挥催化功能以及其代谢中间物UDPG与水稻叶片细胞程序性死亡导致的类病变存在怎样的关系属于技术空白的问题。附图说明图1是本专利技术实施例提供的OsUAP1酶活性及点突变对酶活性的影响示意图。图2是本专利技术实施例提供的OsUAP1突变导致UDPG代谢失调示意图。图3是本专利技术实施例提供的UDPG促进突变体类病变的发生示 意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术通过体外酶活测定以及植物体内代谢中间物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的含量分析，发现OsUAP1只能催化UDPG单向分解，而不催化其合成；OsUAP1点突变(G280E)使得酶活性显著降低；体内分析表明，OsUAP1knock down突变体中UDPG含量显著升高，萄糖焦磷酸化酶(UGPases)活性下降，而过表达OsUAP1则可明显降低UDPG含量，表明OsUAP1是UDPG代谢的关键酶之一。此外，还发现施加外源UDPG会加速突变体植株坏死斑发生，推测UDPG积累是诱发水稻类病变产生的一个重要因素。本专利技术的结果有助于解析植物类病变发生以及PCD调控的分子机制，为明确糖类代谢在高等植物生长发育中的重要作用提供依据；由于类病变发生通常导致植物抗病反应的组成性表达以及对病原菌抗性的增强，结果具有应用于水稻育种实践的潜在价值；UAP1的基因序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。1.材料与方法1.1重组蛋白的诱导表达与纯化将重组载体转化原核表达菌株BL21，进行重组蛋白的原核诱导表达和体外纯化。1.1.1重组蛋白的原核诱导表达：(1)将阳性克隆接种到3mLLB培养基(含50μg/mLkanamycin，34μg/mLchloramphenicol)，37℃，220rpm摇菌6～8h；(2)将上述菌液全部接种到50mL LB培养基，220rpm摇菌，使菌液达到饱和状态；(3)取上述菌液20mL，接种到1LLB液体培养基(含34μg/mL chloramphenicol)，37℃，220rpm摇菌；(4)待菌液A600＝0.4～0.6，将摇床温度降至16℃；(5)加入0.2mM IPTG诱导8h；(6)4℃，6000rpm，离心5min，收集菌体。1.1.2His-tag重组蛋白体外纯化所需溶液：pH＝8.0平衡液(A液)：磷酸钠缓冲液(50mM)、NaCl(0.3M)以及咪唑(10mM)pH＝8.0洗脱液(B液)：磷酸钠缓冲液(50mM)、NaCl(0.3M)以及咪唑(250mM)(1)往重组载体转化的BL21菌体中加入10mL A液，悬浮菌体，用超声破碎仪破碎菌体(置于冰上操作)；(2)4℃，12000rpm，离心30min，取上清；(3)Bio-Rad蛋白低压层析系统进行纯化。先用超纯水冲洗柱床至紫外检测器的吸收值靠近基线水平；再用3-5倍柱体积A液冲洗；按A液:细菌裂解上清＝1:1上样，流速1mL/min。上样完成后，用A液冲洗柱床，尽量冲去没有结合的蛋白质和杂质，直至紫外检测器的吸收值靠近基线水平。用B液进行洗脱，流速1mL/min，2mL收集管分步收集紫外检测到的重组蛋白。以上纯化步骤均在低温层析柜(4℃)中完成。(4)重组蛋白SDS-PAGE电泳。1.2酶促反应过程：反应缓冲液：MgCl2 5mMUDPG或Glc-1-P 0.8mMTris-HCl(pH7.5) 10mM反应体系为1mL：在新鲜配制的反应缓冲液中加入5μg原核表达蛋白，再加入100mM焦磷酸钾盐10μL(用于UDPG分解反应)或20mM UTP 10μL(用于UDPG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种类病变基因UAP1，其特征在于，所述类病变基因UAP1的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
【技术特征摘要】
1.一种类病变基因UAP1，其特征在于，所述类病变基因UAP1的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。2.如权利要求1所述的类病变基因UAP1，其特征在于，所述类病变基因UAP1的催化特性为OsUAP1催化UDPG单向分解，不催化UDPG合成；OsUAP1点突变G28...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖桂青，张海文，黄荣峰，卢向阳，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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