本发明专利技术提供了一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白16kD‑38kD‑19kD，并将其应用于肺结核的临床诊断。选用结核分枝杆菌的三个强抗原表位，利用PCR方法，以H37RV为模板构建的一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白，利用DNA‑水凝胶无细胞体外蛋白表达系统表达融合蛋白，利用金属螯合亲和层析技术对得到的重组蛋白进行纯化，最后以其为抗原，利用斑点金免疫渗滤技术制备新型结核分枝杆菌血清学检测试剂盒。与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、敏感性高等优点，为结核病的筛查和诊断提供更可靠的工具，亦可用于制备蛋白芯片、疫苗、单抗和多抗等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地涉及一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白的构建及其应用。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, TB）感染引起慢性感染病，结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。随着结核分枝杆菌耐药株的流行传播、卡介苗免疫效果的降低以及人口流动等多重因素的影响，全球结核病疫情发展日益严峻，研究表明，受结核菌感染的人群中，10 %的人会发展为结核病。如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。目前，我国肺结核的治愈率已经达90 %以上，但目前结核病的诊断还主要依靠痰涂片检查和痰结核菌培养并结核影像学结果，而痰结核菌培养最大的缺点则是培养时间长，一般需要4-6周。此外，由于肺结核早期最常见的症状是咳嗽和咳痰，容易使患者和医生误以为是感冒或气管炎而导致误诊，而延误了最佳治疗时机。因此，开发新的、快速、简单、方便、敏感性高的结核病诊断方法对于遏制结核病在我国的流行具有重要意义。血清学检测是指在体外进行的抗原抗体反应，其基本原理是基于抗原可与相应的抗体特异性结合的特性，利用已知的抗原来检查血清或其它样品如卵黄、牛奶中是否含有相应的抗体。在结核病的检测中，由于结核菌抗原复杂，抗体种属特异性不易确定，因此敏感性较低，血清学诊断现仅作为结核病的辅助诊断和鉴别诊断。目前结核血清学诊断试剂盒主要为TB-DOT和Rapid Test，均是是基于单一的结核杆菌重组抗原（38kD抗原）原理，但大量的文献和临床资料表明，由于结核病人抗体反应存在异质性，把单一抗原用于血清学诊断存在敏感性低而假阳性率较高的缺陷。由于人群中感染结核菌非常普遍，健康人也会携带较低水平的抗结核菌抗体，因此检测试剂的灵敏度过高，会出现假阳性，而过低又会使低水平抗体的结核病患者漏诊，所以，目前关于结核病抗体的检测结果差异较大，在临床应用上的评价也不一致。针对上述问题，建立结核病快速诊断技术的关键是寻找具有种的特异性以及具有较强免疫原性的结核分枝杆菌抗原，并构建一系列特异性抗原的科学、合理的组合或含有结核杆菌关键表位的融合蛋白，在保证较高特异性的基础上提高诊断的敏感性。
技术实现思路
（一）要解决的技术问题本专利技术目的是构建结核分枝杆菌16kD-38kD-19kD三联重组融合蛋白，利用斑点金免疫渗滤技术（DIGFA）生产特异性高、假阳性低的新型结核分枝杆菌血清学检测试剂盒，为结核病提供一种可靠、方便、快速的临床诊断方法。（二）技术方案本专利技术根据NCBI数据库检索得到结核杆菌H37Rv标准菌株16kD、19kD以及38kD基因序列，设计合成引物，经PCR、TA克隆后，酶切纯化3段基因片段，与pET28a载体进行依次重组，首先构建pET28a-16kD重组质粒，鉴定成功基础上继续酶切与38kD片段连接，鉴定成功后，进一步酶切与19kD片段连接，酶切鉴定，最终获得pET-28a-16kD-38kD-19kD重组表达载体，测序鉴定16kD-38kD-19kD重组融合序列重组成功。本专利技术应用DNA-水凝胶无细胞体外蛋白表达系统表达重组融合蛋白。首先合成X-DNA，应用Apa I酶切对融合蛋白质粒进行线性化，同无核酸酶水、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液等组成DNA凝胶反应混合液；然后基于磁力搅拌方式制备DNA凝胶微颗粒，并对其进行纯化和鉴定；最后按照RTS 100 E.coli试剂盒制备商业化无细胞反应液，确定无细胞反应的最佳孵育时间、X-DNA以及基因模版的最适浓度。最终获得一种表达结核分枝杆菌16kD-38kD-19kD三联重组融合蛋白的DNA-水凝胶无细胞蛋白表达系统。本专利技术应用金属螯合亲和层析介质技术（metal chelate chromatography）纯化上述步骤中得到的重组融合蛋白，对纯化后的融合蛋白进行氨基酸序列测定，同时应用BCA法测定融合蛋白浓度，应用ELISA法测定融合蛋白活性。最终获得纯度大于96 %的结核分枝杆菌16kD-38kD-19kD三联融合蛋白。本专利技术将上述获得的高纯度重组融合蛋白包被在硝酸纤维素膜上，用胶体金标记葡萄球菌A蛋白（SPA），然后组装渗滤装置，建立并优化斑点金免疫渗滤检测体系，最终获得基于斑点金免疫渗滤技术的新型结核分枝杆菌血清学诊断试剂盒。临床血清样本检测实验表明，该试剂盒的敏感性为（94.5 %），假阳性为（2.7 %）。（三）有效效益采用本专利技术提供的结核分枝杆菌16kD-38kD-19kD重组融合蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，更好的满足了结核分枝杆菌感染临床诊断的需要。附图说明图1是表达载体pET-16kD-38kD-19kD的构建流程图；图2是表达载体pET-16kD-38kD-19kD的酶切电泳图，A：单基因酶切点电泳图，1：Marker，2：16kD，3：38kD，4：19kD；B：融合基因酶切电泳图，1：Marker，2：酶切前的重组质粒，3：16kD，4：16kD+38kD，5：16kD+38kD+19kD；图3是X-DNA的4条寡核苷酸序列及检验电泳图，1：X1，2：X1+X2，3：X1+X2+X3，4：X1+X2+X3+X4；图4是DNA-水凝胶蛋白表达系统表达蛋白的金属螯合层析亲和纯化凝胶电泳图，1：Marker，2：纯化前，3：纯化后。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的保护范围。实施例1：结核分枝杆菌16kD-38kD-19kD重组融合蛋白的制备及纯化1.1 基因融合通过计算机分析TB H37Rv基因组全序列，选择其强抗原表位16kD（GENEBANK locus：NP_214765）、38kD蛋白（GENEBANK locus：HG813240）和19kD（GENEBANK locus：CP007027）的DNA序列为模板，设计扩增引物为：16kD扩增引物：16-38-19a：GGAAGGCATATGAACAATCTCGCATTGTGGTCGC16-38-19b：TTATTAGGATCCTCCGCCACCCTTCGTGATGGCGATG19kD扩增引物：16-38-19c：AATAGAATTCGGAGGTGGCGGTAGTGTGAAGCGTGGACTGA16-38-19d：GTCCGGAAGCTTTTAGGAACAGGTCACCTCGATTTCG38kD扩增引物：16-38-19e：GCTGACGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATAC16-38-19f：GTATTAGAATTCGCTGGAAATCGTCGCGATC50 ml扩增体系：ddH2O 31.5 ml，10×buffer 5.0 ml，4×dNTP 4.0 ml，上、下游引物混液4.0 ml，DNA 1.5 ml，Taqplus 0.2 ml（1 U）。取结核分支杆菌H37RV的菌体，加100 ml蛋白酶K（10 mg/ml），置56 ℃水浴消化4 h，用常规酚/氯仿法纯化，用上述引物进行PCR扩增。其中，16kD上游引物增加NdeI酶切位点，下游增加BamHI酶切位点；38kD上游引物增加BamHI酶切本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码结核分枝杆菌三联重组融合蛋白16kD‑38kD‑19kD的融合基因，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1. 一种编码结核分枝杆菌三联重组融合蛋白16kD-38kD-19kD的融合基因，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2. 一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白16kD-38kD-19kD，其特征在于：它是由权利要求1中的融合基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3. 一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白的表达载体，其特征在于：它是将权利要求1中的融合基因按照图1所示的构建方式连接到pET28a载体上，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.一种DNA-水凝胶无细胞蛋白表达系统，其特征在于：它是以由四条寡核苷酸序列退火结合而成的X-DNA为骨架的水凝胶结构，其合成后验证结果如图3所示。...
【专利技术属性】
技术研发人员：常琳，王兴，张新慧，
申请(专利权)人：沈阳万类生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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